羅婷 ，楊文忠，張珊珊

(1.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650201)

合理施肥不僅可以提高肥料利用效率、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、協(xié)調(diào)土壤養(yǎng)分，還對(duì)增強(qiáng)植物的抗逆性有重要的作用[1-3]。通常我們研究植物生命活動(dòng)與外界環(huán)境相互關(guān)系時(shí)，主要是通過植物體內(nèi)物質(zhì)和能量的調(diào)控與代謝過程來實(shí)現(xiàn)的，大多數(shù)選用與植物保護(hù)酶系統(tǒng)、膜脂過氧化作用、滲透調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)的可溶性蛋白、丙二醛、過氧化物酶和過氧化氫酶等生理生化指標(biāo)來進(jìn)行研究。在植物的生長發(fā)育過程中，每種必須的礦質(zhì)元素都有其獨(dú)特的功能，各種元素之間互相作用，影響著植物體內(nèi)一系列的生理生化過程[4]。N在植物體內(nèi)含量較高，是酶、蛋白質(zhì)、核酸、生物激素等化合物的重要組成部分，直接或間接地影響植物體內(nèi)代謝過程[5-6]，對(duì)植物生理活動(dòng)發(fā)揮重要的作用[7]。P主要對(duì)植物生長發(fā)育、細(xì)胞分裂、光合作用等過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，能促進(jìn)根系發(fā)育，提高樹木抗寒性和抗旱性，同時(shí)也是多種酶的組成部分[8]。K是以離子狀態(tài)(K+)的形式游離在植物體內(nèi)，參與細(xì)胞代謝和滲透壓調(diào)節(jié)，并對(duì)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成起促進(jìn)作用。N、P、K肥是植物生長發(fā)育中所必需的大量元素，研究表明，適當(dāng)施用N、P、K肥可提高多種植物葉片中可溶性蛋白、丙二醛、過氧化物酶和過氧化氫酶等生理指標(biāo)的含量，進(jìn)而提高其抗逆性[9]。

植物營養(yǎng)缺乏癥研究主要通過視覺觀察和數(shù)據(jù)比對(duì)來進(jìn)行，傳統(tǒng)的育苗肥料試驗(yàn)主要用土壤作為固體基質(zhì)，但土壤本身就含有大量養(yǎng)分，在進(jìn)行微量元素和常量元素缺乏癥研究時(shí)會(huì)存在一定困難。越來越多的無土系統(tǒng)研究表明，水培試驗(yàn)對(duì)植物營養(yǎng)缺乏癥研究更為適宜，對(duì)各種礦物質(zhì)養(yǎng)分的控制更為精準(zhǔn)[10-11]。水培試驗(yàn)研究在國外起步較早，1838年德國科學(xué)家通過水培試驗(yàn)研究出植物生長發(fā)育需要的15種營養(yǎng)元素。1842年，德國科學(xué)家威格曼用蒸餾水來栽培植物獲得成功，這是開展植物營養(yǎng)液栽培的真正開始[12]。到了20世紀(jì)30年代美國科學(xué)家Hoagland 和Amon研究出了Hoagland營養(yǎng)液配方，并闡明了在營養(yǎng)液中加入微量元素的重要性，Hoagland營養(yǎng)液配方得到大家的認(rèn)可并成為了營養(yǎng)液配制的標(biāo)準(zhǔn)配方[13]。

紅椿(Toonaciliata)為楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)的半常綠喬木，國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)的珍貴速生用材樹種，其木材為上等家具用材[14]。現(xiàn)在由于資源過度開發(fā)利用，生境破碎化嚴(yán)重，紅椿自然更新難度大，種子小、難收集且易喪失活力。為了高效地利用紅椿，目前已對(duì)其瀕危機(jī)制[15]、外植體組培研究[16]、扦插技術(shù)[17]、容器育苗造林技術(shù)[14]、生物活性[18]、叢枝菌根及群落結(jié)構(gòu)[19]等進(jìn)行研究；且對(duì)干旱脅迫及復(fù)水下紅椿幼苗生理生化響應(yīng)機(jī)制研究比較多，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫的加深紅椿幼苗的抗氧化酶活性先增加后減少，丙二醛(MDA)含量逐漸增加，脯氨酸(Pro)含量逐漸增加[20]；在噴施外源亞精胺后，可以顯著提高抗氧化酶活性，且顯著減少了MDA和Pro的積累[21]，而對(duì)紅椿苗期施肥方面研究未見報(bào)道。因此，本研究基于改良的Hoagland營養(yǎng)液，通過化合物替代法設(shè)置不同N、P、K濃度，研究不同N、P、K水平處理對(duì)紅椿幼苗可溶性蛋白(Cpr)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)等6個(gè)生理指標(biāo)的影響，探明紅椿幼苗生理指標(biāo)與N、P、K的需求關(guān)系，制定出合理的施肥方案，能更好地培育壯苗，縮短苗木出圃時(shí)間，促進(jìn)苗木優(yōu)質(zhì)增產(chǎn)。研究結(jié)果可為紅椿在干熱地區(qū)植樹造林、推廣種植等林業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用苗為種子播種一個(gè)月后長勢(shì)基本一致的幼苗。育苗設(shè)施選用周轉(zhuǎn)箱和聚苯乙烯制作而成的育苗托盤。試驗(yàn)用營養(yǎng)液以改良的Hoagland液為母液[22]，其中N、P、K元素的濃度分別為0.015、0.001及0.006 mol/L。本試驗(yàn)以改良的Hoagland營養(yǎng)液配方為依據(jù)，保持微量元素及鐵鹽濃度不變，將N、P、K等3種元素分別配制成原有母液中濃度的0、0.5、1、1.5、2、2.5 倍，即6個(gè)水平。缺N處理設(shè)計(jì)為將母液中的含氮化合物替換為0.002 5 mol/L的K2SO4、0.004 mol/L的CaSO4；缺P處理是將母液中的KH2PO4去除，KNO3濃度調(diào)整為0.006 mol/L；缺K處理是將母液中的KNO3去除，KH2PO4替換為0.000 5 mol/L的Ca(H2PO4)2(表1)。

表1 缺素處理Tab.1 Treatment of element deficiency mol/L

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)用SPSS 16.0作N、P、K3因素6水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共產(chǎn)生36個(gè)處理。每個(gè)處理用1個(gè)周轉(zhuǎn)箱，一個(gè)周轉(zhuǎn)箱內(nèi)種植12株幼苗，相當(dāng)于12個(gè)重復(fù)，共用432株幼苗。試驗(yàn)在云南省林業(yè)和草原科學(xué)院樹木園溫室內(nèi)進(jìn)行，自然光照、溫度和濕度?；谡辉囼?yàn)設(shè)計(jì)，用純凈水配置不同處理的營養(yǎng)液，每3 d添加一次純凈水到原始水位，每30 d更換一次營養(yǎng)液。在周轉(zhuǎn)箱中添加2～3滴氯霉素滴眼液，防止藻類生長。試驗(yàn)期限6個(gè)月。

1.3 測(cè)定方法及數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)束后葉片采樣，同一處理的每株都取樣，且每株盡量選取同一部位功能葉片，采取混合樣，每個(gè)處理三分樣，相當(dāng)于3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

SOD活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[24]，CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定[23]，采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定POD的酶活性[23]，Cpr含量測(cè)定采用BCA(bicinchonininc acid)法[23]，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[24]，Pro含量測(cè)定采用磺基水楊酸提取法[23]。

用軟件SPSS 18.0 S和Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析，差異顯著性在a=0.05水平上用Duncan法進(jìn)行多重比較分析，所有指標(biāo)數(shù)據(jù)表格和柱狀圖用Excel 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)紅椿幼苗葉片超氧化物歧化酶活性的影響

不同營養(yǎng)液配方條件下，紅椿幼苗葉片的SOD活性差異情況如圖1所示。紅椿幼苗SOD活性在處理29(N2P2K1)時(shí)最大，比不添加氮磷鉀的處理1(N0P0K0)增加了148.30%，差異顯著。處理1與5、6之間差異不顯著，數(shù)值較低， 29與14、31之間差異不顯著，數(shù)值較大。

圖1 不同處理?xiàng)l件下紅椿幼苗的超氧化物歧化酶活性含量注：表中同行不同小寫字母代表差異性顯著(P<0.05)，下圖同。Fig.1 The SOD activity in leaves of T.ciliata seedlings under different treatments

對(duì)N、P、K不同水平做多重比較，結(jié)果見表2。

表2 氮磷鉀不同水平間超氧化物歧化酶活性的多重比較Tab.2 The Multiple comparison of SOD enzyme activity at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium U/g

由表2可知，K肥對(duì)紅椿幼苗SOD活性的影響較N肥、P肥顯著。隨著N元素濃度的增加，SOD活性隨之增強(qiáng)，但是N1.5、N2.0和N2.5三者之間差異不顯著，說明是N肥能有效地促進(jìn)紅椿幼苗SOD活性的增強(qiáng)；隨著P元素濃度的增強(qiáng)，SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，P1.0水平時(shí)值最大，但是P1.5與P1.0和P2.0之間差異不顯著，表明低濃度P肥對(duì)紅椿幼苗生長有一定的促進(jìn)作用；隨著K元素濃度的提高，SOD活性變化趨勢(shì)與對(duì)P元素的響應(yīng)相同，在K1.5水平時(shí)達(dá)到峰值，證明適當(dāng)濃度的K對(duì)紅椿幼苗SOD活性有顯著促進(jìn)作用，濃度過高反而抑制酶活性。

2.2 不同處理對(duì)紅椿幼苗葉片過氧化物酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，紅椿幼苗葉片POD活性在29號(hào)處理時(shí)活性最大，比不添加N、P、K的1號(hào)處理增加了233.91%，其次為14號(hào)處理(圖2)。

圖2 不同處理?xiàng)l件下紅椿幼苗的過氧化物酶活性Fig.2 The POD activity in leaves of T.ciliata seedlings under different treatments

不同處理間的方差分析結(jié)果顯示(表3)，隨著N、P、K濃度的增加，POD活性顯著提高，每種元素的各個(gè)水平之間都存在顯著差異，且N0、P0、K0水平的POD活性均低于其他水平，說明施肥總體上可以提高紅椿幼苗葉片的POD活性。POD活性隨著N肥濃度水平的提高顯著增強(qiáng)，受N元素影響顯著；P0.5水平下的POD活性顯著高于其余水平，說明低水平P肥對(duì)紅椿幼苗葉片的POD活性影響顯著，隨著P肥濃度水平的提高，紅椿幼苗葉片的POD活性呈降低趨勢(shì)；K1.5水平時(shí)POD活性最大，說明適當(dāng)濃度的K肥可以促進(jìn)紅椿幼苗的POD活性。

表3 氮磷鉀不同水平間過氧化物酶活性的多重比較Tab.3 The multiple comparison of POD activity in leaves at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium U/g

2.3 不同處理對(duì)紅椿幼苗葉片過氧化氫酶活性的影響

由圖3可知，紅椿幼苗的CAT活性同樣是在29號(hào)處理?xiàng)l件下最高，比對(duì)照增加了361.11%，與14號(hào)處理間差異不顯著。其余處理對(duì)CAT活性的影響沒有對(duì)POD及SOD的顯著(P<0.05)。

圖3 不同處理?xiàng)l件下紅椿幼苗的過氧化氫酶活性Fig.3 The CAT activity in leaves of T.ciliata seedlings under different treatments

由表4可以看出，N、P、K過高或是過低都會(huì)顯著抑制紅椿幼苗的CAT活性。隨著各元素的濃度增加，CAT活性均呈先增后降的趨勢(shì)。其中，N2水平、P0.5和P1水平、K1.5水平下的CAT活性最高，顯著高于其余水平，說明較高水平下的N肥和K肥，及較低水平的P肥可以促進(jìn)CAT活性。

表4 氮磷鉀不同水平間過氧化氫酶活性的多重比較Tab.4 The multiple comparison of CAT activity in leavesat different levels of nitrogen,phosphorus and potassium nmol/(min·g)

2.4 不同處理對(duì)紅椿幼苗葉片丙二醛含量的影響

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，反映了植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。從圖4可看出，MDA含量最低的為處理22，其次為14號(hào)和31號(hào)，最高的是不添加N、P、K的處理1。其余不同處理水平間的MDA含量差異不顯著。

圖4 不同處理?xiàng)l件下紅椿幼苗葉片的丙二醛含量Fig.4 The MDA content in leaves of T.ciliata seedlings under different treatments

通過多重比較得到表5，可以看出，隨著N肥濃度的增加，紅椿幼苗葉片的MDA積累的量逐漸減少，N2.5水平時(shí)MDA積累最少，其中N0.5、N1、N1.5、N2.5水平之間MDA含量變化差異不顯著(P<0.05)；隨著P肥和K肥含量的升高，MDA含量都呈現(xiàn)先降后升高的變化，分別在P1.5和K1.5時(shí)達(dá)到最低值，表明過低或過高水平的P肥和K肥對(duì)細(xì)胞膜脂過氧化影響不大；適當(dāng)濃度的P肥和K肥可對(duì)保護(hù)細(xì)胞膜，減弱細(xì)胞膜質(zhì)過氧化有顯著作用。

表5 氮磷鉀不同水平間紅椿幼苗葉片丙二醛含量的多重比較Tab.5 The multiple comparison of MDA content in leaves at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium nmol/g

2.5 不同處理對(duì)紅椿幼苗葉片脯氨酸含量的影響

Pro對(duì)不同的N、P、K水平處理的響應(yīng)變化見圖5。紅椿幼苗葉片Pro含量最高的為處理29，其次為14號(hào)、31號(hào)和26號(hào)，都顯著高于不添加N、P、K肥的處理1。

圖5 不同處理?xiàng)l件下紅椿幼苗葉片的脯氨酸含量Fig.5 The Pro in leaves content of T.ciliata seedlings under different treatments

通過多重比較分析(表6)，添加了N、P、K肥的紅椿幼苗葉片中Pro含量均比不添加N、P、K肥的處理高，證明施肥對(duì)Pro的積累有促進(jìn)作用。N2.5水平時(shí)Pro含量最高，說明N肥對(duì)Pro積累的影響顯著；P0.5水平時(shí)Pro含量最高，濃度過高反而會(huì)抑制Pro的產(chǎn)生；K肥各個(gè)水平之間差異較顯著，適當(dāng)水平的K1對(duì)Pro的積累有顯著效果。

表6 氮磷鉀不同水平間脯氨酸含量的多重比較Tab.6 The multiple comparison of Pro content in leaves at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium μg/g

2.6 不同處理對(duì)紅椿幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

Cpr是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。由圖6可以看出，紅椿幼苗葉片中Cpr含量最高的是處理14，其次為29號(hào)和31號(hào)，Cpr含量最低的是不含N、P、K肥的處理1。其余處理間差異不是很顯著。

圖6 不同處理?xiàng)l件下紅椿幼苗葉片的可溶性蛋白含量Fig.6 The Cpr in leaves content of T.ciliata seedlings under different treatments

由表7可以看出，紅椿幼苗葉片中Cpr含量會(huì)隨著N元素含量的增加而增加，N0時(shí)最低，N1、N1.5、N2、N2.5水平之間的差異不顯著，說明高濃度N肥對(duì)Cpr積累有促進(jìn)作用；P1時(shí)Cpr含量達(dá)到最高值103.23 mg/g，P0與P0.5、P1與P1.5、P2與P2.5之間差異均不顯著；K1.5水平時(shí)Cpr含量最高，K0與K0.5水平之間不存在顯著差異，可以看出低水平K肥對(duì)Cpr的積累沒有顯著效果，隨著K肥水平的增加Cpr含量適量增加，但是過高濃度的K會(huì)抑制Cpr的積累。

表7 氮磷鉀不同水平間可溶性蛋白含量的多重比較Tab.7 The multiple comparison of Cpr content in leaves at different levels of nitrogen,phosphorus and potassium mg/g

2.7 氮磷鉀的交互作用

在不同水平N、P、K處理下，除MDA外，N×K和N×P交互對(duì)紅椿幼苗葉片其余5個(gè)生理指標(biāo)有顯著的促進(jìn)作用，這說明紅椿幼苗生理生化過程對(duì)N肥的依賴最大； P×K交互對(duì)紅椿幼苗生理指標(biāo)無顯著影響(表8)。

表8 氮磷鉀交互作用對(duì)紅椿幼苗葉片生理指標(biāo)的影響Tab.8 The effects of interaction of nitrogen,phosphorus and potassium on physiological indexes of T.ciliata seedlings

3 討論與結(jié)論

3.1 水培條件下氮磷鉀與紅椿幼苗保護(hù)酶的變化關(guān)系

POD、SOD、CAT是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，可幫助植物通過調(diào)節(jié)自身的保護(hù)酶防御系統(tǒng)來維護(hù)細(xì)胞正常的代謝和反應(yīng)[25-26]。SOD是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的重要酶類，POD與CAT是主要清除自由基的酶類；CAT能夠?qū)Ｒ磺宄鼿2O2，POD也會(huì)在脅迫加劇的時(shí)候引發(fā)膜質(zhì)或氧化作用表現(xiàn)為傷害效應(yīng)。隨著N肥水平的增加，POD、SOD、CAT活性呈明顯的上升趨勢(shì)，且表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，這與陳彩霞等[20]對(duì)干旱脅迫下紅椿幼苗抗氧化酶活性變化趨勢(shì)一樣，說明在逆境時(shí)，植物體內(nèi)大量活性氧堆積，超出了抗氧化酶承受范圍導(dǎo)致植物加速氧化。N是構(gòu)成蛋白質(zhì)的必需組分，尤其是高濃度的N對(duì)幼苗抗氧化酶的積累有明顯提高作用，這與徐海軍等[27]對(duì)五味子(Schisandrachinensis)及楊曉清等[28]對(duì)土沉香(AquilariaSinensis)的研究結(jié)論是一致的。低水平的P肥和適當(dāng)水平的K肥可促進(jìn)紅椿幼苗的保護(hù)酶活性達(dá)到最優(yōu)。

3.2 水培條件下氮磷鉀與紅椿幼苗細(xì)胞膜脂過氧化作用的變化關(guān)系

逆境時(shí)，植物的最初反應(yīng)就是增加體內(nèi)的活性氧代謝，導(dǎo)致積累大量的自由基，引發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化。MDA是細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，其含量的高低可以間接判斷出細(xì)胞膜脂過氧化的程度[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，MDA含量隨著N和K施肥水平的增加逐漸降低，在N2.5和K1.0水平時(shí)含量最低；隨著P施肥水平的增加，MDA含量表現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢(shì)，且K肥各水平之間差異不明顯，表明K肥對(duì)MDA含量影響不大，這與付曉鳳等[24]對(duì)1 a生扁桃(MangiferapersiciformisC.)的施肥配比研究一致。在P1.5水平時(shí)，MDA含量最低，表明N、P、K肥因濃度配比的不同表現(xiàn)出不同的相互協(xié)同或拮抗作用，且P合理施用是很重要的。

3.3 水培條件下氮磷鉀與紅椿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化關(guān)系

植物對(duì)逆境的代謝反應(yīng)趨勢(shì)基本是相同的，大都會(huì)增強(qiáng)水解作用，使得植物體內(nèi)的大分子物質(zhì)降解為可溶性糖、Cpr、Pro、游離氨基酸等物質(zhì)來提高細(xì)胞液濃度，以降低滲透勢(shì)[30]。Pro親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低凝固點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。紅椿幼苗Pro含量隨著N肥的施用水平增加而增加，隨著P肥、K肥的施用水平增加表現(xiàn)出先升高再降低的變化，且分別在N2.5、P0.5、K1水平時(shí)含量最高，也間接地說明了3種肥料的相互作用，且對(duì)P肥比較敏感，少量施用肥效發(fā)揮的更好。大多數(shù)植物體內(nèi)的Cpr是參與各種代謝的酶類，是了解植物體內(nèi)代謝水平的一個(gè)重要指標(biāo)，且Cpr會(huì)和Pro相互作用增加蛋白質(zhì)的親水性[30]。N元素尤其對(duì)Cpr影響較顯著，高濃度的N元素對(duì)幼苗Cpr積累有明顯提高作用，這與周維[31]對(duì)格木幼苗做N、P、K配比施肥試驗(yàn)時(shí)得到的結(jié)果相同。隨著P濃度的升高，紅椿幼苗Cpr先增加后降低。

N、P、K肥不僅對(duì)各指標(biāo)有不同的促進(jìn)作用，且肥效的發(fā)揮還受三者相互影響的作用，配施合理表現(xiàn)為協(xié)調(diào)促進(jìn)作用，配施不合理會(huì)出現(xiàn)拮抗抑制作用。從N、P、K肥交互作用可以看出，N×K交互對(duì)紅椿幼苗生理指標(biāo)有顯著的促進(jìn)作用，N×P交互次之，P×K交互對(duì)紅椿幼苗生理指標(biāo)無促進(jìn)作用，且各指標(biāo)值均低于不加氮磷鉀處理，這說明紅椿幼苗生理生化過程對(duì)N肥的依賴最大，且紅椿幼苗對(duì)P肥比較敏感，低濃度磷肥就能顯著地促進(jìn)紅椿幼苗的生理指標(biāo)，高濃度P反而會(huì)產(chǎn)生拮抗作用。本試驗(yàn)可以證明紅椿幼苗對(duì)N、P、K肥的依賴性為N>K>P。

施肥是加速植物生長發(fā)育的重要手段之一，而研究植物對(duì)各種礦物營養(yǎng)元素的需求及各種礦物元素之間關(guān)系最快速、最簡單的就是水培營養(yǎng)系統(tǒng)[26]，與固體基質(zhì)相比，水培系統(tǒng)可在受控環(huán)境中更精準(zhǔn)地推斷出植物生長所需要的最佳施肥水平。研究表明，以改良的Hoagland液為水培營養(yǎng)液母液，N、P、K水平分別為母液中N、P、K濃度的2倍、2倍和1倍時(shí)，紅椿幼苗生理指標(biāo)最佳。本試驗(yàn)結(jié)果可為紅椿育苗過程中的合理施肥提供理論依據(jù)。