寧德山，梁峰，趙宏偉，3*，程江，王磊，尹麗華，葉小敏

1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510520；

2.廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司，廣東 廣州 510632；

3.中國中藥協(xié)會(huì) 藥食同源物質(zhì)評(píng)價(jià)和利用專業(yè)委員會(huì)，北京 100061；

4.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430075

隨著人們生活節(jié)奏的加快，多種因素導(dǎo)致越來越多的人處于亞健康狀態(tài)[1-3]，這是一種處于健康和疾病之間的一種生理狀態(tài)，免疫力下降是其主要特征之一[4-6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織一項(xiàng)全球性的研究預(yù)測，全球有75%的人群處于亞健康狀態(tài)，而中國保健學(xué)會(huì)2022 年7 月對(duì)中國16 個(gè)百萬以上人口的城市居民抽樣調(diào)查顯示，亞健康狀態(tài)的人群達(dá)總?cè)丝跀?shù)的70%以上[7-8]。中醫(yī)自古就有“治未病”理念，亞健康狀態(tài)就處于易病未病的狀態(tài)，與傳統(tǒng)中醫(yī)藥的未病先防理論不謀而合。多種中草藥具有免疫調(diào)節(jié)功能，其中以真菌類和補(bǔ)益類藥食同源中藥居多，成分以多糖類為主。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，枸杞子[9-10]、茯苓[11-12]、香菇[13-14]、桑 椹[15-16]、菊花[17-18]、黨 參[19-20]、猴 頭菇[21-22]、金 針菇[23-24]、銀耳[25-26]等中草藥均具有免疫調(diào)節(jié)作用，其活性成分諸如多糖、生物堿等參與機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫過程，具有不良反應(yīng)少、不易產(chǎn)生耐藥性、多靶點(diǎn)作用等特點(diǎn)。保健保本草菁萃是以上述天然中草藥為原料，經(jīng)過不同的組方配比篩選出的復(fù)方保健食品，在前期的研究中，本課題組已經(jīng)建立了制劑工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，然而其如何發(fā)揮功效尚不明確，長期使用的安全性也有待驗(yàn)證。本研究依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）[27]有關(guān)要求，對(duì)保健保本草菁萃的安全性和增強(qiáng)免疫功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為其應(yīng)用提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株和細(xì)胞

無特定病原體（SPF）級(jí)昆明種小鼠20 只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，用于急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)。

SPF 級(jí)SD 大鼠88 只，體質(zhì)量75～90 g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，用于30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

SPF 級(jí)近交系雄性Balb/C 小鼠120 只，體質(zhì)量18～22 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041，用于免疫功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房為屏障系統(tǒng)，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，人工照明12 h 晝夜更替。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2014-0077，使用證明號(hào)：00270497。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102，批號(hào)分別為5281D、5282D、5249D、5280D，購自上海康成生物科技有限公司，-80 ℃保存，經(jīng)生物學(xué)特性鑒定合格后用于實(shí)驗(yàn)。

小鼠淋巴瘤細(xì)胞YAC-1 為暨南大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室自傳代，支原體檢測為陰性。

1.2 試藥

保健保本草菁萃由無限極（中國）有限公司提供（批號(hào)：Q1611019），為棕黃色粉劑，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水現(xiàn)配成各質(zhì)量濃度。

敵克松（批號(hào)：SLBC6145V）、2-氨基笏（2-AF，批號(hào)：20100526）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：D8418）均購于Sigma 公司；疊氮化鈉（NaN3，批號(hào)：S8200，Amresco 公司）；1,8-二羥基蒽醌（批號(hào)：C1706017，Aladdin 公司）；代謝活化系統(tǒng)用大鼠肝S9（批號(hào)：3772，Moltox公司）；RPMⅠ 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（批號(hào)：11875093，賽默飛世爾公司）；刀豆蛋白A（ConA，批號(hào)：C8110）、4%多聚甲醛（批號(hào)：P1110）、吉姆薩染液（批號(hào)：G1015）、補(bǔ)體（豚鼠血清，批號(hào)：S4990）、綿羊紅細(xì)胞（SRBC，批號(hào)：S9450）、雞紅細(xì)胞（批號(hào)：S9454）均購自北京索萊寶科技有限公司；2,4-二硝基氟苯（DNFB，批號(hào)：F830061，上海麥克林生化科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒（批號(hào)：C0016）、胎牛血清（批號(hào)：C0228）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

PB 302 型電子天平（梅特勒-托利多公司）；BS 110S 型電子天平 [賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；SW-CJ-1F 型標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)（蘇州吳江華夏空調(diào)凈化設(shè)備廠）；LT-BⅠX300L 型低溫生化培養(yǎng)箱 [立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司]；H-1850R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）；TS-110X50 型恒溫?fù)u床（上海天呈科技有限公司）；XT-2000i 型全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀（希森美康公司）；BS-820 型全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；ASP200S 型真空組織脫水機(jī)、EG1150 型包埋機(jī)、EG1150C 型包埋冷凍臺(tái)、RM2265 型全自動(dòng)切片機(jī)、HⅠ1210 型攤片機(jī)、HⅠ1220型烤片機(jī)均購自Leica Biosystems Nussloch GmbH 公司；DM2500 型顯微照相儀（Leica Microsystems 公司）；Elx800 型酶標(biāo)儀（Bio-Tek 公司）；UV-2600 型分光光度計(jì)（Shimadzu公司）；YA28X6T/8型高壓滅菌鍋（寧波甬安醫(yī)療器械制造有限公司）；DK-24 型恒溫水浴鍋、DHG-9053A 型鼓風(fēng)干燥箱均購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ECLⅠPSE-TⅠ2 型倒置顯微鏡（尼康儀器有限公司）；PHS-3C 型pH 計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技有限公司）；ⅠM1200型全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 [艾力特生物科技（上海）有限公司]。

2 方法

2.1 保健保本草菁萃的制備

將檢驗(yàn)合格的枸杞子、茯苓、香菇、桑椹、菊花、黨參、金針菇、猴頭菇和銀耳藥材去除雜質(zhì)，按質(zhì)量比10∶10∶10∶10∶5∶5∶5∶3∶2 稱量并投入提取罐內(nèi)，加入12 倍量的水煎煮提取2.5 h，濾過后收集濾液，濾渣重新加10 倍量的水煎煮2 h，收集濾液，合并2 次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（35±5）%。濃縮液加入40 份的菊粉，攪拌均勻后投入真空帶式干燥機(jī)，干燥物料經(jīng)粉碎后過100目篩，即得保健保本草菁萃粉劑。

2.2 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

稱取受試物25.89 g，用純水定容至40 mL，得到能通過小鼠灌胃器的最大質(zhì)量濃度0.65 g·mL-1的供試液。取SPF 級(jí)昆明種小鼠20 只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，禁食16 h后按20 mL·kg-1灌胃給予上述供試液，每日3 次（間隔4 h），1 日內(nèi)總劑量為38.83 g·kg-1，相當(dāng)于人攝入量的1177倍（以每日口服2 g、體質(zhì)量60 kg 計(jì)，折算劑量為0.033 g·kg-1）。連續(xù)觀察灌胃后4 h 內(nèi)和14 d 內(nèi)毒性反應(yīng)、存活情況。對(duì)死亡動(dòng)物作大體解剖[28]。

2.3 Ames實(shí)驗(yàn)（平板滲入法）

取鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102 菌株，采用平板滲入法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在加和不加S9 活化系統(tǒng)條件下，受試物設(shè)5000、1000、200、40、8 μg/皿5個(gè)劑量組，另設(shè)二甲基亞砜（DMSO）溶劑對(duì)照、自發(fā)回變對(duì)照和陽性對(duì)照。陽性對(duì)照采用敵克松、NaN3、2-AF、1,8-二羥基蒽醌，劑量分別為50.0、2.5、10.0、50.0 μg/皿。每組3個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算平均回變菌落數(shù)。在加或不加S9 活化系統(tǒng)條件下，1株以上的菌回變菌落數(shù)≥溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的2倍，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，或1 個(gè)以上劑量具有可重復(fù)的并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽性結(jié)果，可判斷該受試物細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。陰性結(jié)果需至少做2次測試，陽性結(jié)果至少做3次測試[29]。

2.4 30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

取SPF級(jí)SD大鼠88只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組雌雄各11 只。受試物高、中、低劑量組灌胃劑量分別為3.30、1.65、0.83 g·kg-1·d-1，相當(dāng)于人體推薦量的100、50、25倍，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，給予等量蒸餾水。各組每天灌胃1次，連續(xù)30 d。每天觀察并記錄大鼠的行為、體征、呼吸、中毒癥狀和死亡狀況；每周稱1次體質(zhì)量、2次食物攝入量，按照公式（1）計(jì)算每周食物利用率。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，將大鼠禁食不禁?6 h，腹主動(dòng)脈采血測定血液學(xué)指標(biāo)及血生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLU）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（TCHO）、三酰甘油（TG），計(jì)算ALB/球蛋白比值（ALB/GⅠO）。然后將大鼠脫頸椎處死，大體解剖后肉眼觀察有無明顯病變，取肝、腎、脾、性器官等臟器進(jìn)行稱量，計(jì)算臟體比，并對(duì)肝、腎、脾、胃腸、性器官等臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[30]。

2.5 免疫功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

選用SPF 級(jí)近交系雄性Balb/C 小鼠120 只，體質(zhì)量18～22 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為12 組，每組10 只，其中4 組用于脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和自然殺傷（NK）細(xì)胞活性測定，4 組用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，4 組用于抗體生成細(xì)胞檢測和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。受試物低、中、高劑量組分別灌胃0.17、0.33、1.00 g·kg-1·d-1，相當(dāng)于人體推薦量的5、10、30 倍，對(duì)照組給予等量蒸餾水。連續(xù)灌胃30 d后，各組小鼠根據(jù)檢測指標(biāo)方法進(jìn)行相應(yīng)處理取樣。飼養(yǎng)期間自由飲食，每周稱量記錄體質(zhì)量1次，并根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量[27]。

2.5.1脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 小鼠給予受試物30 d后，無菌取脾臟，Hank's 液中放置，用鑷子將脾臟剪碎研磨，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，過200 目篩網(wǎng)濾過，Hank's液清洗2 次，每次離心10 min（1000 r·min-1，離心半徑6 cm），然后將細(xì)胞懸液懸浮于完全培養(yǎng)基，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/mL。將每份細(xì)胞懸液加入24 孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，設(shè)2 個(gè)復(fù)孔，1 孔加入ConA 溶液（終質(zhì)量濃度為7.5 μg·mL-1）作為實(shí)驗(yàn)孔，另1 孔作為空白。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育培養(yǎng)72 h。噻唑藍(lán)（MTT）法在波長570 nm 下檢測每孔的吸光度（A），用實(shí)驗(yàn)組A減去空白孔A代表淋巴細(xì)胞的增殖能力，受試物組細(xì)胞的增殖能力顯著高于對(duì)照組，判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.5.2耳腫脹法檢測遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）小鼠給予受試物30 d 后，腹部脫毛約3 cm×3 cm，用10 mg·mL-1DNFB 溶液50 μL 均勻涂抹致敏。5 d后，用DNFB 溶液10 μL 均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊，攻擊后24 h 頸椎脫臼處死，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm 的耳片，稱定質(zhì)量。用左右耳片質(zhì)量之差表示DTH 的程度，受試物組的質(zhì)量差值顯著高于與對(duì)照組的質(zhì)量差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.5.3抗體生成細(xì)胞檢測（改良法）小鼠給予受試物30 d 后，腹腔注射2%的SRBC 懸液0.2 mL 進(jìn)行免疫，4 d后小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，制備為5×106CFU·mL-1細(xì)胞懸液。胎牛血清經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（5∶1）吸收，4 ℃，30～60 min 后加入不完全培養(yǎng)基RPMⅠ 1640 中，制備成含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。將底層培養(yǎng)基（1.4%瓊脂糖）融化后，傾入6 孔板，凝固后于37 ℃?zhèn)溆?。將頂層培養(yǎng)基（0.7%瓊脂糖）融化后，分裝小試管，每管0.5 mL，50 ℃水浴保溫，再向管內(nèi)加20% SRBC 50 μL、脾細(xì)胞懸液200 μL，迅速混勻傾倒于6孔板中并鋪平頂層混合液，每個(gè)樣本做2個(gè)平行孔。待凝固后，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，每孔加入以完全培養(yǎng)基稀釋的補(bǔ)體（1∶10）500 μL，繼續(xù)孵育2 h，計(jì)數(shù)1×106個(gè)脾細(xì)胞的溶血空斑數(shù)。受試物組空斑數(shù)顯著高于對(duì)照組空斑數(shù)，可判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.5.4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 小鼠給予受試物30 d后，腹腔注射2% SRBC懸液0.2 mL進(jìn)行免疫，4 d后小鼠頸椎脫臼處死，腹腔注射加胎牛血清的Hank's 溶液4 mL，輕按揉腹部20 次，充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞。腹腔壁剪開一個(gè)小口，用膠頭吸管吸取腹腔洗液2 mL。用加樣器吸取0.5 mL腹腔洗液加入到含1%雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL 的試管內(nèi)，混勻。吸取混合液0.5 mL 加到24 孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，孵育結(jié)束后迅速用0.9%氯化鈉溶液將未貼壁的細(xì)胞洗掉，4%多聚甲醛溶液固定1 min，吉姆薩染色液染色15 min。沖洗，晾干，用40×顯微鏡計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞和被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)，按公式（2）～（3）計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。受試物組吞噬率、吞噬指數(shù)與對(duì)照組吞噬率、吞噬指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.5.5NK 細(xì)胞活性測定 實(shí)驗(yàn)前將靶細(xì)胞YAC-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用RPMⅠ 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL，備用。小鼠給予受試物30 d后，頸椎脫臼處死，無菌取脾臟，制備2×107個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL [效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞（50∶1）] 加入到96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，作為反應(yīng)孔。靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大稀釋孔加靶細(xì)胞和1% NP40 各100 μL。各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，然后將培養(yǎng)板進(jìn)行低速離心5 min（1000 r·min-1，離心半徑6 cm），每孔吸取上清液100 μL 轉(zhuǎn)至96 孔培養(yǎng)板內(nèi)。利用LDH 檢測試劑盒，490 nm 檢測每孔的A。按照公式（4）計(jì)算細(xì)胞活性。受試物組的NK 細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的NK 細(xì)胞活性，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)大鼠行動(dòng)自如、飲食正常、精神狀態(tài)良好，未見明顯中毒癥狀，也無死亡，表明保健保本草菁萃劑量在38.83 g·kg-1·d-1時(shí)無毒性。

3.2 Ames實(shí)驗(yàn)

4 個(gè)菌株在加和不加S9 活化系統(tǒng)條件下，受試物各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變組和溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的2 倍，亦無劑量-反應(yīng)關(guān)系，因此判定保健保本草菁萃Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性，沒有致突變作用。2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1～2。

表1 保健保本草菁萃第1次Ames實(shí)驗(yàn)回變菌落數(shù)（,n=3）

表1 保健保本草菁萃第1次Ames實(shí)驗(yàn)回變菌落數(shù)（,n=3）

表2 保健保本草菁萃第2次Ames實(shí)驗(yàn)回變菌落數(shù)（,n=3）

表2 保健保本草菁萃第2次Ames實(shí)驗(yàn)回變菌落數(shù)（,n=3）

3.3 30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

3.3.1一般狀況觀察 實(shí)驗(yàn)期內(nèi)各組動(dòng)物行為表現(xiàn)正常，無死亡和中毒癥狀。受試物各劑量組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。受試物各劑量組大鼠每周食物利用率與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4)。

表3 保健保本草菁萃對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（,n=11）

表3 保健保本草菁萃對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（,n=11）

表4 保健保本草菁萃對(duì)大鼠食物利用率的影響（,n=11）

表4 保健保本草菁萃對(duì)大鼠食物利用率的影響（,n=11）

3.3.2血液學(xué)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢裳獧z測主要血液學(xué)指標(biāo)，各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。受試物各劑量組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表5。

表5 保健保本草菁萃對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（,n=11）

表5 保健保本草菁萃對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（,n=11）

3.3.3血液生化學(xué)指標(biāo) 由表6 可以看出，受試物1.65、0.83 g·kg-1劑量組尿素氮水平與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但這些差異的劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯，屬正常生理范圍內(nèi)的波動(dòng)，無毒理學(xué)意義；其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 保健保本草菁萃對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響（,n=11）

表6 保健保本草菁萃對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響（,n=11）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3.4臟器質(zhì)量和臟體比 由表7～8 可得，受試物各劑量組大鼠肝臟、腎臟、脾臟、卵巢（雌性）、睪丸（雄性）的臟器質(zhì)量和臟體比與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表7 保健保本草菁萃對(duì)大鼠臟器質(zhì)量的影響（,n=11）

表7 保健保本草菁萃對(duì)大鼠臟器質(zhì)量的影響（,n=11）

3.3.5大體解剖及病理組織學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解剖各組大鼠，肉眼觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃腸等主要臟器未見明顯病變。取大鼠各臟器做病理組織學(xué)切片檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組1 只大鼠腸黏膜輕度水腫，其他組織均未見明顯病理變化；受試物3.30 g·kg-1劑量組1 只大鼠肝組織內(nèi)淋巴細(xì)胞局灶性增生，肝組織輕微淤血，肝細(xì)胞輕微脂肪變性，胃黏膜局灶性變性壞死脫落，黏膜下淤血，腸黏膜上皮細(xì)胞變性壞死脫落，腸絨毛鈍化縮短，其余大鼠各臟器未見明顯病理變化。

表8 保健保本草菁萃對(duì)大鼠臟體比的影響（,n=11）

表8 保健保本草菁萃對(duì)大鼠臟體比的影響（,n=11）

各組均只有個(gè)別大鼠出現(xiàn)病理變化，且病變性質(zhì)和程度無明顯差異，所有病變類型在大鼠中為常見的自發(fā)性病理改變，無明顯生物學(xué)意義。

3.4 免疫功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

3.4.1脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 由圖1 可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量受試物30 d 后，與對(duì)照組比較，受試物低劑量組對(duì)ConA 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組對(duì)ConA 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明受試物中、高劑量能明顯促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

圖1 保健保本草菁萃對(duì)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（,n=10）

3.4.2遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 對(duì)照組、受試物各劑量（1.00、0.33、0.17 g·kg-1）組大鼠左右耳質(zhì)量差分別為（17.09±3.49）、（14.54±2.11）、（14.41±2.00）、（15.65±3.81）mg，與對(duì)照組比較，受試物各劑量組大鼠左右耳質(zhì)量差值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明受試物各劑量對(duì)大鼠DTH 程度沒有明顯影響。

3.4.3抗體生成細(xì)胞檢測 由圖2 可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量受試物30 d 后，與陰性對(duì)照組相比，受試物低、中劑量組空斑數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組空斑數(shù)顯著增多（P＜0.01）。結(jié)果表明，受試物低、中劑量組對(duì)抗體生成細(xì)胞水平?jīng)]有明顯影響，高劑量組能明顯提高抗體生成細(xì)胞水平。

圖2 保健保本草菁萃對(duì)抗體生成細(xì)胞的影響（,n=10）

3.4.4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 由圖3～4 可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量受試物30 d 后，與對(duì)照組相比，受試物低、中劑量組細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組吞噬率和吞噬指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明，受試物低、中劑量組對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力沒有明顯影響，高劑量能明顯提高巨噬細(xì)胞吞噬能力。

圖3 保健保本草菁萃對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率的影響（,n=10）

圖4 保健保本草菁萃對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響（,n=10）

3.4.5NK 細(xì)胞活性測定 由圖5 可知，經(jīng)口給予小鼠不同劑量受試物30 d 后，與對(duì)照組相比，受試物低、中劑量組NK 細(xì)胞活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組NK 細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明受試物低、中劑量對(duì)NK 細(xì)胞活性沒有明顯影響，高劑量能明顯提高NK 細(xì)胞活性。

圖5 保健保本草菁萃對(duì)NK細(xì)胞活性的影響（,n=10）

4 討論

本研究采用小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)、Ames實(shí)驗(yàn)和大鼠30 d 喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)保健保本草菁萃進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明受試物對(duì)小鼠急性經(jīng)口最大耐受量（MTD）＞38.83 g·kg-1，根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003 版）急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)得出，此受試物屬于無毒物質(zhì)；受試物Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性，未顯示出致突變作用；30 d 喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，受試物對(duì)大鼠生長發(fā)育、血液學(xué)、血液生化學(xué)、主要臟體比及組織病理學(xué)檢測均未產(chǎn)生不良影響。由此可見，保健保本草菁萃作為食品是安全可靠的。

機(jī)體免疫系統(tǒng)由非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫3 個(gè)方面組成，能夠識(shí)別和清除入侵人體的抗原成分、體內(nèi)的衰老細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及異常突變細(xì)胞等，從而保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定[31]。本研究采用正常動(dòng)物模型，從細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及NK 細(xì)胞活性4 個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)保健保本草菁萃對(duì)小鼠免疫功能的影響。脾臟是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要免疫器官之一，由T 細(xì)胞和B 細(xì)胞組成。脾淋巴細(xì)胞增殖是細(xì)胞免疫功能最直接的指標(biāo)。受試物中、高劑量能明顯促進(jìn)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；外周血、肝臟、脾臟是NK 細(xì)胞常常存在的部位，NK 細(xì)胞可以清除病變細(xì)胞，延緩細(xì)胞的衰老，極大地提高機(jī)體免疫力。當(dāng)機(jī)體受到感染后，NK細(xì)胞發(fā)生活化，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。NK 細(xì)胞可以識(shí)別靶細(xì)胞，活化吞噬細(xì)胞，釋放殺傷介質(zhì)，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力。研究結(jié)果表明，受試物高劑量可增強(qiáng)NK細(xì)胞活性；顯著提高抗體生成細(xì)胞水平，對(duì)體液免疫應(yīng)答是有益的；顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬能力，單核巨噬細(xì)胞為一種機(jī)體非特異性免疫的重要細(xì)胞，其吞噬能力是可用于反映機(jī)體非特異性免疫功能。

綜上所述，保健保本草菁萃可通過調(diào)節(jié)小鼠非特異性免疫、細(xì)胞免疫、體液免疫及NK 細(xì)胞活性，從而達(dá)到增強(qiáng)免疫力的作用；在毒性研究中未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。