王思微 牛韻婷 張婷婷

(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗中心，遼寧 沈陽 110032；2沈陽醫(yī)學(xué)院)

重癥肌無力(MG)是一種機(jī)體產(chǎn)生抗神經(jīng)肌肉接頭乙酰膽堿受體(AChR)抗體等自身抗體的自身免疫性疾病，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)在突觸后膜傳遞障礙，出現(xiàn)骨骼肌疲勞的臨床表現(xiàn)，具有組織器官特異性〔1〕。其發(fā)病機(jī)制往往與機(jī)體的免疫功能失衡相關(guān)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一種介導(dǎo)免疫耐受的CD4+細(xì)胞，其主要功能是通過控制T細(xì)胞的活化與增殖來抑制體內(nèi)的免疫反應(yīng)，使重癥肌無力的炎癥反應(yīng)趨于慢性〔2〕。樹突細(xì)胞(DC)是一種專職抗原提呈細(xì)胞，在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與免疫耐受環(huán)節(jié)有重要作用，根據(jù)不同來源與功能可分為髓樣DC(mDC)與漿細(xì)胞樣DC(pDC)，pDC可以誘導(dǎo)自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)的分化維持機(jī)體的自身免疫耐受，并誘導(dǎo)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，與MG等自身免疫性疾病發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，但研究甚少。本研究旨在分析MG患者外周血中pDC與Treg細(xì)胞的含量，探討其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常在MG患者中的表現(xiàn)。

1 資料與方法

1.1研究對象 2018年7月至2020年6月就診于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的老年初診并未接受治療的MG患者112例，其中男58例，女54例，年齡60～83歲，平均(72.85±8.13)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均按照MG治療和診斷中國專家共識〔3〕明確診斷為MG；不合并其他自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)；不合并腫瘤、感染等疾??；無嚴(yán)重的心腦血管疾??；無精神類疾病能配合研究。將MG組分為無胸腺受累組60例與胸腺受累組52例(按照影像學(xué)與病理學(xué)診斷劃分)。按照MG定量評分(QMG)標(biāo)準(zhǔn)對患者進(jìn)行評分。另外選取同期健康體檢人員68例為對照組，年齡61～78歲，男35例，女33例。3組性別、年齡無統(tǒng)計學(xué)差異，均知情同意，研究通過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要儀器與試劑 試劑：人外周血單個核細(xì)胞分離液，購自挪威Axis-Shield公司；人Treg試劑盒，熒光標(biāo)記為Foxp3(PCH101)-APC，CD4-FITC，CD25-PE，購自eBioscience公司；熒光標(biāo)記為Lin-1-FITC，CD123-PE，anti-HLA-DR-PerCP，CD11c-APC的單克隆抗體均購自美國BD公司；人乙酰膽堿受體抗體(AChR-Ab)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、人白細(xì)胞介素(IL)-4 ELISA試劑盒、人γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒，均購自南京森貝咖公司。設(shè)備：FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，美國SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀。

1.3標(biāo)本采集與處理 研究對象清晨空腹采集靜脈全血5 ml至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，用3 ml生理鹽水稀釋3 ml全血，室溫下在3 000 r/min離心力低速離心機(jī)中離心20 min，用潔凈吸管吸取中間層的淋巴細(xì)胞層，移至另一離心管中，用2倍體積的生理鹽水稀釋收集到的淋巴細(xì)胞，在1 500 r/min的離心力下，離心10 min，棄去上清，取沉淀，即為淋巴細(xì)胞，用于pDC與Treg細(xì)胞的檢測。另按上述條件采集5 ml全血，室溫13 000 r/min離心10 min，收集血清用于IL-4與IFN-γ的檢測。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測pDC與Treg 將分離后的淋巴細(xì)胞懸液用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋濃度至1×106個ml。pDC的流式檢測：取流式專用潔凈試管加入稀釋好的淋巴細(xì)胞100 μl，加入Lin-1-FITC抗體20 μl，CD123-PE抗體10 μl，anti-HLA-DR-PerCP抗體10 μl，CD11c-APC抗體5 μl，渦旋震蕩混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，加入1 ml PBS洗滌細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，加入300 μl PBS緩沖液混勻，準(zhǔn)備上機(jī)操作。其中Lin-1-anti-HLA-DR+CD123+CD11c-的細(xì)胞群為pDC。Treg細(xì)胞的流式檢測：將100 μl稀釋好的懸液加入另一試管中，加入CD4-FITC、CD25-PE單克隆抗體各10 μl，渦旋震蕩混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，加入PBS 1 ml洗滌細(xì)胞，加入破膜劑250 μl，1 200 r/min離心5 min棄上清，加入Foxp3-APC抗體10 μl，加PBS 300 μl準(zhǔn)備上機(jī)操作。應(yīng)用四色流式細(xì)胞儀上機(jī)操作，應(yīng)用BD CellQuest Pro分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5ELISA檢測血清IL-4與IFN-γ 將收集好的血清用ELISA檢測IL-4與IFN-γ，操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，ELISA試劑盒采用五點定標(biāo)，兩個濃度的質(zhì)控品均在控，且具備符合檢測要求的線性條件及其他性能要求。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各臨床資料比較 胸腺受累組及無胸腺受累組與對照組比較AChR-Ab含量較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；胸腺受累組較無胸腺受累組病程較長、QMG評分較高、AChR-Ab含量較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2不同組別pDC、Treg、IL-4、IFN-γ的含量 胸腺受累組與對照組相比，pDC、Treg、IL-4含量明顯減低，IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)；無胸腺受累組與對照組相比，pDC、Treg細(xì)胞含量明顯減低，IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)；胸腺受累組與無胸腺受累組相比，pDC明顯減低，IFN-γ明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組臨床資料及pDC、Treg細(xì)胞，IL-4、IFN-γ含量比較

2.3各指標(biāo)之間的相關(guān)性 Treg、IL-4與pDC呈正相關(guān)(r=0.840、0.780，P<0.05)，IFN-γ、QMG評分、AChR-Ab與pDC呈負(fù)相關(guān)(r=-0.773、-0.760、-0.816，P<0.05)；IFN-γ、QMG評分、AChR-Ab與Treg呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792、-0.734、-0.816，P<0.05)，IL-4與Treg無顯著相關(guān)性(r=0.356，P>0.05)。

3 討 論

老年MG因其自身運動神經(jīng)系統(tǒng)功能衰退或合并其他心腦血管或自身免疫性疾病而常導(dǎo)致MG的臨床癥狀不明顯而誤診或漏診，發(fā)病早期不易被發(fā)現(xiàn)〔4〕。老年MG患者90%可檢測到AChR抗體，高于其他年齡組〔5〕，并存在更高合并胸腺病變的可能性，我國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)老年MG有26.5%合并胸腺瘤〔6〕。MG是一種自身免疫性疾病，是由T細(xì)胞介導(dǎo)，補(bǔ)體參與的產(chǎn)生特異性AChR抗體的免疫失衡狀態(tài)下的多系統(tǒng)受累的疾病。其免疫系統(tǒng)狀態(tài)的研究是探索疾病形成與發(fā)展的重要切入點。DC的功能強(qiáng)大，一方面具有專職抗原呈遞的功能；另一方面誘導(dǎo)初始T細(xì)胞成為CD4+T細(xì)胞進(jìn)行重要的特異性免疫功能，與此同時其在免疫耐受與免疫穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮重要作用。根據(jù)DC的分化成熟程度，成熟DC發(fā)揮抗原呈遞功能，其表面高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子在內(nèi)的多種分子可誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化，發(fā)揮特異性免疫效能；而未成熟DC能識別、處理抗原信息，但缺乏共刺激分子不能使之與T細(xì)胞表面受體結(jié)合，使T細(xì)胞趨于免疫耐受狀態(tài)〔7〕。

DC在自身免疫性疾病的研究中也逐漸被重視，異常的免疫激活是自身免疫疾病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者表現(xiàn)出更高比例的活化mDCs，SLE患者的mDC和pDC均表現(xiàn)為與其成熟、功能和信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因表達(dá)的改變，并與血清抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體顯著相關(guān)〔8〕。根據(jù)DC來源不同，將其區(qū)分為mDC與pDC，mDC誘導(dǎo)中間階段輔助性T淋巴細(xì)胞(Th0細(xì)胞)向Th1細(xì)胞方向分化，參與特異性免疫應(yīng)答；而pDC誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向分化，參與免疫耐受。DC與MG的關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，在MG患者的胸腺組織中發(fā)現(xiàn)經(jīng)典DC(cDC)密度明顯增高，尤其集中于異位生發(fā)中心及其周圍，證明MG患者胸腺組織不同部位與不同DC種類含量有差異,在組織及外泌體中均有此發(fā)現(xiàn)〔9,10〕。Pei等〔11〕對MG患者外周血DCs進(jìn)行了定量分析發(fā)現(xiàn)DC絕對數(shù)量減少，mDC/pDC減低，證明外周血兩種DC組分失衡，機(jī)體處于自身免疫反應(yīng)與免疫耐受之間的失衡狀態(tài)。

本研究提示在外周的抗原性刺激發(fā)生后，pDC含量的下降導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受程度降低，機(jī)體誘發(fā)強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答，AChR抗體含量增加，加速自身免疫疾病的發(fā)展。胸腺具有大量免疫細(xì)胞和免疫分子，是T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞天然發(fā)育的重要場所，是人類重要的中樞免疫器官，胸腺與MG關(guān)系密切〔12〕，MG患者約有80%合并胸腺異常，其中包括胸腺瘤或胸腺增生等〔13〕。DC是一種胸腺基質(zhì)細(xì)胞，其參與T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的分化與選擇。一些研究中發(fā)現(xiàn)，pDC會從外周血轉(zhuǎn)移至其他組織器官中，參與自身免疫病的形成或組織的破壞〔14〕。本研究顯示，在外周血淋巴細(xì)胞中的pDC減少，證明胸腺受累后外周組織的免疫平衡遭到破壞，但是胸腺受累的MG患者下降更低的情況可能與機(jī)體接受免疫刺激之后，大量pDC從外周血轉(zhuǎn)移至胸腺組織中，結(jié)合其在自分泌大量趨化因子的遷移特性，逐漸成熟過程中參與特異性免疫的應(yīng)答，并促使MG在胸腺中的破壞，此結(jié)果印證了MG患者胸腺中DC含量升高〔9〕與本研究外周血含量下降的特征。

如上述DC誘導(dǎo)強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答的同時，仍發(fā)揮誘導(dǎo)免疫耐受的作用。其中pDC可能通過兩種方式參與免疫耐受的形成，一方面通過抑制T細(xì)胞的免疫應(yīng)答減弱過強(qiáng)的免疫反應(yīng)；另一方面通過誘導(dǎo)Treg生成，發(fā)揮其在外周的免疫耐受功能。Treg是CD4+T細(xì)胞的一種亞型，其整體的作用是使免疫反應(yīng)得到抑制與耐受，與慢性感染或腫瘤的形成關(guān)系密切〔15〕。本研究所探討的是免疫表型為CD4+CD25+FoxP3+的自然Treg，其特定的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，可以分化為其他類型的Treg。Treg數(shù)量及功能上的失調(diào)導(dǎo)致T細(xì)胞被異常激活而形成的自身免疫性損傷也是許多自身免疫性疾病的重要原因。一些研究表明在MG患者中Treg含量減低，所致進(jìn)一步的病理損傷〔16〕，本研究也驗證這一觀點。同時，本研究又發(fā)現(xiàn)，pDC與Treg在維持MG患者的免疫耐受過程中可能發(fā)揮一致性的作用，兩者下降程度呈正相關(guān)。正如其他研究發(fā)現(xiàn)，DC缺乏小鼠會引起自身免疫的發(fā)生，并且DC的減少可以改變外周Treg基因表達(dá)譜的改變，DC通過調(diào)節(jié)Treg功能而保持免疫平衡〔17〕。兩者也被認(rèn)為與腫瘤免疫逃逸的免疫耐受失衡相關(guān)，Hang等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌患者中Foxp3+Treg數(shù)量明顯減低，提示pDCs可誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向Foxp3+Treg分化，兩者共同促使腫瘤的免疫逃逸。本研究也發(fā)現(xiàn)pDCs與Treg在外周血中同時減低，且具有相關(guān)性，可能提示MG患者DC誘導(dǎo)Treg功能減弱，抑制過強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)能力減弱，誘發(fā)免疫失衡，進(jìn)一步加重自身免疫抗體對自身的攻擊。

DC細(xì)胞在誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th1或Th2方向發(fā)展時，常分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子，IL-12可使Th0細(xì)胞向Th1方向發(fā)展，并分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子；而IL-4可使Th0細(xì)胞向Th2方向發(fā)展，并分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子。本研究提示T細(xì)胞可能正處于向Th1方向發(fā)展的趨勢，存在較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。綜上所述，老年MG患者外周血pDC、Treg減低，可能誘導(dǎo)免疫耐受功能下降，機(jī)體處于一個較強(qiáng)的免疫應(yīng)答狀態(tài)，影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。