邢秀玲，趙海鷹，李麗君，高麗華,才蔚濤，王海燕，王 巍，田 菲，孫映雪，劉偉然，杜美容

腫瘤相關(guān)性貧血(CRA)是指腫瘤患者在疾病發(fā)展、治療過程中出現(xiàn)的貧血，機(jī)體內(nèi)血紅蛋白(Hb)濃度降低或外周血單位容積內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量減少，機(jī)體無法對周圍組織與細(xì)胞供氧，進(jìn)而引發(fā)的惡性貧血[1-2]。CRA在采用放療或多種化療腫瘤患者中的發(fā)生率為70%～90%[3]，惡性腫瘤化療所致貧血常導(dǎo)致患者無法繼續(xù)化療和出現(xiàn)一系列貧血癥狀。目前，隨著中藥在臨床中的廣泛應(yīng)用，其在減輕化療藥物毒副作用等方面發(fā)揮了積極作用。黨參性味甘平，歸脾肺兩經(jīng)，具有養(yǎng)血生津、健脾益肺的功效[4]。本研究主要探討黨參多糖對環(huán)磷酰胺(CTX)所致小鼠貧血的治療效果。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：SPF級健康雄性BALB/c小鼠60只，10周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自百農(nóng)實(shí)驗(yàn)動物繁育科技有限公司，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXY(津)2015-0002。實(shí)驗(yàn)動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，相對濕度60%～70%，自由攝食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后備用。

1.1.2藥物與試劑：黨參多糖，純度為98%，購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號20190507；注射用CTX購自江蘇盛迪醫(yī)藥公司，批號H32026196；生理鹽水購自山東魯抗醫(yī)藥公司，批號H20045154；生血寧片購自武漢聯(lián)合藥液有限責(zé)任公司，批號20150305。促紅細(xì)胞生成素(EPO)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒購自美國RB公司，批號DRE30187；多能集落刺激因子(multi-CSF)檢測試劑盒購自上海烜雅生物有限公司，批號XY-SJH-XS1176；CD71、Ter119購自美國BD公司，批號分別為554890及563998。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器：F-800型全自動血球計(jì)數(shù)儀購自日本Sysmex公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，MK3型全自動酶標(biāo)儀購自上海賽默飛世爾有限公司，ROTOFIX 32臺式離心機(jī)購自德國HITTICH公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物造模和分組[5]：按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠均分為空白組、模型組[5]和黨參多糖低、中、高劑量組及陽性對照組6組。模型組和低、中、高劑量組及陽性對照組分別于實(shí)驗(yàn)第1天，按100 mg/kg劑量腹腔注射CTX,每日1次；空白組給予等容積生理鹽水腹腔注射，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)第2天開始，于注射CTX后2 h，低、中、高劑量組分別給予黨參多糖10、20、40 ml/kg灌胃；陽性對照組給予生血寧片，用前將藥片研成細(xì)粉末，用生理鹽水配制，按照400 mg/kg劑量灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。每3日稱體質(zhì)量并檢測小鼠血紅細(xì)胞(RBC)和Hb。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠均自由攝食飲水。

1.2.2RBC、Hb及紅細(xì)胞壓積(HCT)測定：實(shí)驗(yàn)第9天，各組依次經(jīng)鼠尾靜脈取血0.5 ml，置入抗凝試管中，用全自動血球計(jì)數(shù)儀測定RBC、Hb及HCT水平。

1.2.3multi-CSF和EPO測定：實(shí)驗(yàn)第9天，各組依次經(jīng)鼠尾靜脈取血0.5 ml，血液樣品置于室溫自然凝固15 min，然后3000 r/min離心20 min，取血漿于-20 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測血漿multi-CSF和EPO水平。

1.2.4外周血細(xì)胞CD71+和Ter119+測定[6]：同上取各組小鼠尾靜脈血，置入抗凝試管中，紅細(xì)胞裂解液裂解，離心，棄上清，加入PBS液洗滌2次，離心，棄上清，收集細(xì)胞。分別加入抗CD71和Ter119單克隆抗體各10 μl，震蕩混勻，室溫避光反應(yīng)20 min，1000 r/min離心5 min，棄上清，再加入PBS液洗滌2次，1500 r/min離心10 min，用流式細(xì)胞儀檢測CD71+和Ter119+水平。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠RBC、Hb和HCT水平比較 與空白組比較，模型組外周血RBC、Hb和HCT均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組RBC、Hb和HCT均顯著升高(P<0.05)；空白組與陽性對照組比較，RBC、Hb和HCT均無差異(P>0.05)。低劑量組、中劑量組RBC、Hb、HCT明顯低于陽性對照組(P<0.01)，高劑量組RBC、Hb、HCT與陽性對照組比較無差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠外周血RBC、Hb和HCT水平比較

2.2各組小鼠multi-CSF和EPO水平比較 與空白組比較，模型組外周血multi-CSF和EPO水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組multi-CSF和EPO水平均顯著升高(P<0.05); 空白組與陽性對照組比較，multi-CSF和EPO均無差異(P>0.05)。低、中、高劑量組multi-CSF均低于陽性對照組(P<0.01)，且隨著干預(yù)劑量的增加multi-CSF呈升高趨勢；低、中劑量組EPO明顯低于陽性對照組(P<0.01)，高劑量組EPO與陽性對照組比較無差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠multi-CSF和EPO水平比較

2.3各組小鼠外周血CD71+和Ter119+水平比較 模型組CD71+和Ter119+水平顯著低于空白組(P<0.01)；與模型組比較，低、中、高劑量組CD71+和Ter119+水平均顯著升高(P<0.01)；空白組與陽性對照組比較，CD71+和Ter119+水平無差異(P>0.05)。低、中劑量組CD71+和Ter119+水平均低于陽性對照組(P<0.01)，高劑量組CD71+和Ter119+水平與陽性對照組比較無差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠外周血CD71+和Ter119+水平比較

3 討論

CRA是指因腫瘤因素或在腫瘤治療過程中發(fā)生的貧血，是惡性腫瘤常見并發(fā)癥。嚴(yán)重貧血可增強(qiáng)惡性腫瘤的侵襲性，還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響腫瘤的治療效果及患者預(yù)后，降低患者生存質(zhì)量[7-8]。目前臨床針對CRA主要采用輸血或多種生血藥物聯(lián)合治療。輸血常用于嚴(yán)重貧血患者，可迅速糾正貧血癥狀，短期內(nèi)升高Hb，但如果不予病因治療，輸血的療效是短暫的。此外，若患者多次輸血，體內(nèi)可能產(chǎn)生抗體，從而縮短Hb的維持時(shí)間，且輸血后出現(xiàn)的免疫抑制反應(yīng)可促進(jìn)腫瘤生長[9]。

隨著近些年中醫(yī)藥在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，其在改善患者臨床癥狀、減輕放化療毒副作用等方面發(fā)揮了積極作用。CRA屬中醫(yī)“虛勞”“血虛”“血枯”等范疇，多采用補(bǔ)益類中藥治療，黨參是臨床常用的補(bǔ)益類中藥，也是藥食兩用的保健食材，具有養(yǎng)血生津、健脾益肺的功效。我們從中國知網(wǎng)中國學(xué)術(shù)期刊網(wǎng)絡(luò)出版總庫以黨參為主題詞共檢索到2007—2019年發(fā)表的中文期刊4204篇[10]。以黨參為主藥的益中生血膠囊[11]、健脾益腎顆粒[12]、復(fù)方阿膠漿[13]、健脾生血顆粒[14]、圣愈湯[15]等中成藥及中藥古方治療CRA的研究屢見報(bào)道。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黨參含有多糖、黨參昔、甾醇類、三萜類、生物堿、內(nèi)酯類、香豆素類等多種成分，具有提高免疫力、抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)、增強(qiáng)造血功能、調(diào)節(jié)胃腸道功能等多種藥理活性，而黨參多糖是其主要有效成分[16-17]。張曉君等[18]報(bào)道，黨參多糖能促進(jìn)溶血性貧血模型小鼠外周血Hb，增加脾臟結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)，對脾臟代償造血功能有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明，黨參多糖各劑量組較模型組均可增加外周血RBC、Hb和HCT水平，說明黨參多糖對CTX所致貧血具有顯著的療效。

EPO是由腎皮質(zhì)腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞分泌的一種激素樣物質(zhì)，作用于骨髓紅系造血祖細(xì)胞并促進(jìn)其增殖分化。部分CRA發(fā)生原因?yàn)镋PO含量相對不足[19-20]。multi-CSF是造血干細(xì)胞增殖分化的正性調(diào)節(jié)因子，通過與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合傳遞生長、分化信號，調(diào)控造血干細(xì)胞增殖及向各系血細(xì)胞分化、成熟，是造血功能調(diào)節(jié)的重要因子。本研究結(jié)果顯示，黨參多糖低、中、高劑量組較模型組外周血EPO均顯著升高，表明黨參多糖能促進(jìn)造血因子分泌，從而提高造血功能。

CD71是早期紅系祖細(xì)胞向晚期幼稚紅細(xì)胞過渡的一個(gè)特異性抗原標(biāo)志物，CD71和Ter119常被用以標(biāo)記紅系細(xì)胞在體內(nèi)的動態(tài)成熟過程[21]。本研究結(jié)果表明，黨參多糖各劑量組外周血CD71+及Ter119+水平較模型組顯著升高，表明外周血幼稚紅細(xì)胞逐步向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

綜上，黨參多糖能有效改善CTX致小鼠貧血。