李佳逸，陽輝蓉，陳煉紅

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

牦牛被譽(yù)為“高原之舟”，牦牛乳易被人體消化吸收，營養(yǎng)豐富，具有高蛋白、高乳脂率的特點(diǎn)。牦牛乳中蛋白質(zhì)含量比荷斯坦牛乳高約2倍，氨基酸含量較普通荷斯坦牛乳高出近15%[1]。目前，國內(nèi)關(guān)于牦牛乳及乳中成分抗氧化性的研究也日漸深入。楊靜等[2]研究表明，牦牛乳硬質(zhì)干酪中的抗氧化因子較荷斯坦牛乳硬質(zhì)干酪高，使干酪在成熟后期的氧化速率變慢。宋雪梅等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在不同溫度和時(shí)間下成熟的牦牛干酪制備的水溶性肽均具有抗氧化、殺菌和降壓的作用。

酪蛋白是乳蛋白中的主要蛋白質(zhì)，約占乳蛋白含量的80%以上，營養(yǎng)價(jià)值高，功能性強(qiáng)，其獨(dú)特的氨基酸序列具有很高的研究價(jià)值，因此被廣泛應(yīng)用于食藥醫(yī)療領(lǐng)域[4]。酪蛋白可以通過不同的酶解產(chǎn)生不同的生物活性肽，如抑菌肽[5]、抗氧化肽[6]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽[7]。其中抗氧化肽能夠清除體內(nèi)過多的自由基，抑制脂肪氧合酶活性，分解氧化物，增強(qiáng)人體的抗衰老和抗病能力[8-9]。

為進(jìn)一步研究牦牛乳酪蛋白酶解液在體內(nèi)及體外的抗氧化性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究的最佳酶解工藝條件，采用復(fù)合酶解（中性蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶2）制備牦牛乳酪蛋白酶解液，以1,1-二苯-2-苦肼基自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（O2·）、羥自由基（·OH）清除率及還原力為體外抗氧化活性測定指標(biāo)，并設(shè)置小鼠試驗(yàn)對酶解液在體內(nèi)的抗氧化活性進(jìn)行研究，測定小鼠血液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力，旨在為抗氧化功能性產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，開發(fā)出更天然、更安全的抗氧化產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

牦牛乳采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原牧區(qū)，現(xiàn)場將樣品裝入滅菌的采樣瓶中，置于保溫盒內(nèi)當(dāng)日帶回實(shí)驗(yàn)室，于4℃條件下冷藏待用；五周齡SPF級昆明系小鼠：體重（25±2）g，生產(chǎn)許可證號(hào)為SZXK（川）2020-030，購于四川達(dá)碩公司；試驗(yàn)用鼠普通維持飼料，購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

中性蛋白酶（最適反應(yīng)pH為7.0，溫度為55℃，蛋白酶活力60 000 U/g）、胰蛋白酶（最適反應(yīng)pH為8.0，溫度為50℃，蛋白酶活力250 U/mg）、水楊酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、Tris、冰乙酸等，成都瑞普信生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH），美國Sigma公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測試盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HC-2062型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PL303型分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；UV-2100型分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；DZG-303A型純水儀，成都唐氏康寧艾柯科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牦牛乳酪蛋白酶解液的制備

參考本實(shí)驗(yàn)室馬宇驥等[10]的工藝制備牦牛乳酪蛋白酶解液。

取鮮牦牛乳，經(jīng)離心脫脂后加入一定量的去離子水，配制成蛋白濃度為50 mg/mL的溶液。調(diào)節(jié)pH至7.5，42.5℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，加入3%復(fù)合蛋白酶（中性蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶2），酶解150 min，酶解過程中每隔20 min用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)1次pH值，酶解結(jié)束后將pH值調(diào)至7.0，并在沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫，6 000 r/min離心取上清液，冷凍干燥后置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 體外抗氧化活性研究

取牦牛乳酪蛋白酶解液凍干粉，分別用蒸餾水配制濃度為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg/mL的蛋白溶液，測定其DPPH·、O2·、·OH清除率及還原力。

1.2.2.1 DPPH·自由基清除率測定

參照You等[11]的方法測定。配制0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，加入2.5 mL樣品和2.0 mL DPPH溶液，充分搖勻，用錫紙包裹避光反應(yīng)30 min，待反應(yīng)完畢后10 000 r/min離心15 min，以2.0 mL樣品加入2.0 mL無水乙醇為對照組，2.0 mL無水乙醇加入等量DPPH溶液為空白組，在517 nm處測定吸光度。同時(shí)以同濃度VC溶液代替樣品為陽性對照。

式中：A1為樣品組吸光度；A2為對照組吸光度；A3為空白組吸光度。

參照劉靜等[12]的方法測定。將鄰苯三酚和樣液在25℃條件下水浴15 min，依次加入2.8 mL Tris-HCl、0.2 mL鄰苯三酚和1 mL樣品后迅速混勻，用蒸餾水代替樣品溶液為對照組，在325 nm處測定吸光度，反應(yīng)時(shí)間為5 min，每30 s測定1次，反應(yīng)結(jié)束后加入0.1 mL蒸餾水和2.8 mL Tris-HCl緩沖液調(diào)零。橫坐標(biāo)設(shè)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為OD值，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率。同時(shí)以同濃度VC溶液代替樣品作為陽性對照。

式中：V1為對照組鄰苯三酚自氧化的速率；V2為樣品組鄰苯三酚氧化的速率。

1.2.2.3 ·OH清除率測定

參照董玉瑋等[13]的方法稍作修改。依次加入2 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇、2 mL 9 mmol/L FeSO4、2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液和2 mL樣品后充分搖勻，空白組樣品取2 mL蒸餾水代替樣品溶液，對照組加2 mL蒸餾水代替H2O2，37℃反應(yīng)60 min，充分反應(yīng)后于510 nm處測定吸光度。同時(shí)以同濃度VC溶液代替樣品作為陽性對照。

式中：A1為樣品組吸光度值；A2為空白組吸光度值；A3為對照組吸光度值。

1.2.2.4 還原力測定

參照王穎穎等[14]的方法并略作修改。

精確量取2.5 mL樣品，加入2.5 mL PBS緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液后迅速混勻，50℃水浴保溫30 min。反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫，再加入2.5 mL 10%（m/V）三氯乙酸溶液，振蕩混勻后以6 000 r/min離心50 min。吸取2.5 mL上清液，加入等量蒸餾水和0.5 mL 0.1%氯化鐵，混勻后于25℃水浴保溫10 min，在700 nm處測定OD值，以雙蒸水為空白樣。

1.2.3 體內(nèi)抗氧化活性研究

1.2.3.1 小鼠分組、飼喂及采樣方法

SPF級昆明系小鼠40只，雌雄各半，預(yù)試3 d后進(jìn)入正式期（排除小鼠因?yàn)檫\(yùn)輸造成應(yīng)激反應(yīng)影響試驗(yàn)結(jié)果），將小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只并進(jìn)行編號(hào)（雌雄各半且分隔飼養(yǎng)），分籠飼養(yǎng)于環(huán)境溫度22～26℃，相對濕度50%～60%的動(dòng)物房中，每天光照12 h，自由進(jìn)食進(jìn)水，喂養(yǎng)普通維持飼料，每天更換飲水和墊料，分組情況見表1。

表1 小鼠灌胃分組Table 1 Mouse gavage grouping

每日上午9點(diǎn)對對照組和試驗(yàn)組小鼠經(jīng)口灌胃0.25 mL蒸餾水和不同濃度酶解液[15]，周期30 d，同時(shí)每組每日供應(yīng)等量的顆粒飼料，自由進(jìn)食進(jìn)水。試驗(yàn)期間保持實(shí)驗(yàn)房溫度為（24±2）℃，每日12 h燈光照明。

末次灌胃后禁食24 h，將小鼠稱重并用乙醚麻醉后進(jìn)行心臟采血，將血液置于1 mL EP管中，室溫下靜置30 min，于4℃下以3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于-80℃待檢測。

取小鼠脾臟稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)。

脾臟指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體重（g）

1.2.3.2 體內(nèi)抗氧化分析

分別采用SOD、MDA、GSH-Px試劑盒進(jìn)行檢測，并按各說明書的公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)測定3次，結(jié)果取平均值，采用SPSS V22.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳酪蛋白酶解液體外抗氧化活性研究

2.1.1 酶解液對DPPH·清除能力的分析

如圖1所示，蛋白濃度在0～30.0 mg/mL時(shí)，牦牛乳酪蛋白酶解液的DPPH·清除能力隨著蛋白濃度的增加而顯著升高，當(dāng)濃度大于30.0 mg/mL后，DPPH·的清除能力雖仍繼續(xù)增加，但不再顯著提升。樣品中的DPPH·清除率達(dá)到66.45%±1.59%時(shí)的蛋白濃度為50 mg/mL。VC的DPPH·清除率在濃度0～15.0 mg/mL時(shí)有顯著提升，之后增長緩慢，濃度為50.0 mg/mL時(shí)，VC的DPPH·清除率達(dá)到89.02%±1.07%。結(jié)果表明，牦牛乳酪蛋白酶解液的DPPH·清除率始終低于VC，但仍具有一定強(qiáng)度的抗氧化活性，在蛋白濃度為50.0 mg/mL時(shí)，DPPH·的清除率達(dá)到同濃度VC的74.45%。

圖1 不同濃度酶解液的DPPH·清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates with different concentrations

圖2 不同濃度酶解液的O2·清除能力Fig.2 Superoxide radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates with different concentrations

2.1.3 酶解液對·OH清除能力的分析

研究表明，·OH易與氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等游離基團(tuán)相結(jié)合，從而造成細(xì)胞損傷導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生疾病甚至癌癥等危害。由圖3可以看出，牦牛乳酪蛋白的酶解液·OH清除能力在0～40.0 mg/mL時(shí)隨著蛋白濃度的提高而顯著增強(qiáng)，之后清除率基本保持不變。在蛋白濃度為5.0 mg/mL時(shí)，樣品對·OH的清除率只有15.36%±0.68%，但當(dāng)濃度升至50.0 mg/mL時(shí)，樣品對·OH的清除率達(dá)到了60.40%±1.96%，是相同濃度下VC對·OH清除率的61.65%；樣品與VC的·OH清除能力在濃度0～10.0 mg/mL時(shí)基本相同。但隨著濃度的增加，酶解液的·OH清除能力增速低于VC，當(dāng)濃度升至30.0 mg/mL時(shí)，VC對·OH清除率顯著高于樣品。

圖3 不同濃度酶解液的·OH清除能力Fig.3 Hyroxyl radical scavenging activity of enzymatic hydrolysates with different concentrations

2.1.4 酶解液還原力分析

由圖4可知，牦牛乳酪蛋白酶解液還原力整體隨著蛋白濃度的增加而增強(qiáng)，但濃度在15.0～20.0 mg/mL時(shí)，蛋白濃度對牦牛乳酶解液的還原力影響并不顯著。當(dāng)濃度達(dá)到25.0 mg/mL后，繼續(xù)增加濃度，VC的還原力不再顯著增強(qiáng)。樣品的還原力在蛋白濃度為50 mg/mL時(shí)是相同濃度下VC還原力的63.03%。隨著濃度的增加，酶解液與VC的還原能力的差距逐漸縮小，但酶解液的還原力始終小于VC。

圖4 不同濃度酶解液的還原力Fig.4 Reducing power of enzymatic hydrolysates with different concentrations

2.2 牦牛乳酪蛋白酶解液體內(nèi)抗氧化活性研究

2.2.1 牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠體重及免疫功能的影響

由表2可見，飼喂30 d后，試驗(yàn)組小鼠體重均高于對照組。與對照組相比，低劑量組小鼠體重?zé)o顯著變化，中劑量組和高劑量組的小鼠體重均顯著增加（P＜0.05），且高劑量組的體重增加最多。牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠脾臟指數(shù)的影響，與對照組相比，低、中和高劑量組均有顯著增加（P＜0.05），且中劑量組與高劑量組之間無顯著性差異。

表2 牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠體重增重及脾臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of yak casein hydrolysate on weight gain and spleen index of mice

酪蛋白酶解釋放的酪蛋白活性肽可增加小鼠的鈣吸收率及儲(chǔ)留率。除此之外，酪蛋白水解物還含有小分子肽及各類游離氨基酸，小分子肽對動(dòng)物的生長有促進(jìn)作用[16]，但具體成分及機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。在之前的研究中，鄭華等[17]研究發(fā)現(xiàn)：用酪蛋白飼喂小鼠24 d后，小鼠體重顯著高于對照組；飼喂36 d后，小鼠體重極顯著高于對照組，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說明酪蛋白可促進(jìn)小鼠的生長。

機(jī)體的非特異性免疫情況可由脾臟指數(shù)體現(xiàn)。有研究指出，免疫與抗氧化存在著相輔相成的關(guān)系[17]。在本試驗(yàn)中，脾臟指數(shù)與牦牛乳酪蛋白酶解液劑量成正比，表明牦牛乳酪蛋白酶解液可以促進(jìn)小鼠的非特異性免疫。在陳東平等[18]的研究中發(fā)現(xiàn)，用不同分子量的酪蛋白肽飼喂小鼠30 d后，飼喂大于3 ku酪蛋白肽的分組，小鼠脾臟指數(shù)顯著高于對照組，1～3 ku及小于1 ku的分組，小鼠脾臟指數(shù)極顯著高于對照組，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致，說明牦牛乳酪蛋白酶解液在30 d時(shí)可顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)，表明酶解液對小鼠具有顯著抗氧化作用。

2.2.2 牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠血清中SOD活力的影響

如表3所示，飼喂牦牛乳酪蛋白酶解液30 d后，與對照組相比，低劑量組、中劑量組及高劑量組的小鼠血清對SOD活力影響均有顯著提高（P＜0.05），低、中、高劑量組的SOD活力分別提高約5.65%、12.34%和16.22%，且各組間差異顯著（P＜0.05）。

表3 牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠血清中SOD活力的影響Table 3 Effect of yak casein hydrolysate on SOD activity in serum of mice

研究證明：人體衰老、心腦血管等疾病均與人體內(nèi)SOD活力的降低有關(guān)[19]；同時(shí)，生物的致死率上升與機(jī)體內(nèi)的SOD活性下降呈正相關(guān)[20-21]。Lee等[22]在研究鴨皮組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，提高SOD活性可抑制抗氧化系統(tǒng)損傷，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。在本試驗(yàn)中，用不同劑量的酪蛋白酶解液飼喂小鼠30 d后發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組的小鼠血清中SOD活力明顯高于對照組，且低、中、高劑量組的SOD活力呈梯度性變化，說明牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠SOD活力的提高有顯著影響，進(jìn)而提升小鼠的抗氧化能力。

2.2.3 牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠血清中MDA含量的影響

由表4可見，經(jīng)30 d飼喂牦牛乳蛋白酶解液后，低、中、高劑量組小鼠血清中MDA含量與對照組之間差異顯著（P＜0.05），但試驗(yàn)組間差異不顯著，低、中、高劑量組的MDA含量相較于對照組分別下降了約17.96%、19.39%和23.67%，呈逐漸下降的趨勢。

表4 牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠血清中MDA含量的影響Table 4 Effect of yak casein hydrolysate on MDA content in serum of mice

機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，非酶系統(tǒng)能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，由此引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，最終形成脂質(zhì)的過氧化物（酮基、羰基、醛基等）。MDA作為其中主要的毒性產(chǎn)物，不僅可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，致使細(xì)胞凋亡，而且也可改變DNA及RNA序列的轉(zhuǎn)錄翻譯工作，使細(xì)胞環(huán)境失衡[23]。因此，MDA含量能間接地反映出細(xì)胞氧化損傷的程度，其與機(jī)體受損程度呈正相關(guān)。

本試驗(yàn)中，小鼠在飼喂酪蛋白酶解液30 d后，血清中的MDA含量明顯下降，說明酪蛋白酶解液可有效減少機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物，降低細(xì)胞的損傷程度，提高機(jī)體的抗氧化作用。

2.2.4 牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠血清中GSH-Px活力的影響

由表5可以看出，低、中、高劑量組小鼠血清中GSH-Px活力均顯著高于對照組（P＜0.05），但試驗(yàn)組之間差異不顯著。低、中、高劑量組的GSH-Px活力較對照組分別升高了約30.89%、37.72%和48.98%，呈逐漸上升的趨勢。

表5 牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠血清中GSH-Px活力的影響Table 5 Effect of yak casein hydrolysate on GSH-Px activity in serum of mice

GSH-Px能將還原性谷胱甘肽（Glutathione,GSH）催化為氧化型谷胱甘肽，是測定GSH活性水平的指標(biāo)之一[24]，其濃度可影響GSH對毒性物質(zhì)的降解效果以及清除超氧陰離子自由基的效率，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。因此，測定GSH-Px活力可用來作為判別機(jī)體抗氧化性能的指標(biāo)。本試驗(yàn)中可以看出，牦牛乳酪蛋白酶解液可以提高機(jī)體GSH-Px活力，從而提高機(jī)體的抗氧化能力。

3 結(jié)論

體外試驗(yàn)通過在最優(yōu)酶解條件下制備牦牛乳酪蛋白酶解液，測定其抗氧化活性指標(biāo)。結(jié)果表明：酶解液在蛋白濃度為50 mg/mL時(shí)對DPPH·、·OH、O2·均具有一定的清除能力，蛋白濃度在0～30.0 mg/mL時(shí)的DPPH·清除率和·OH清除率均隨著濃度的增加而顯著增強(qiáng)，二者在濃度為50.0 mg/mL時(shí)的清除率分別達(dá)到66.45%±1.59%和60.40%±1.96%，相當(dāng)于相同濃度下VC對其清除率的74.45%和61.65%。還原能力除15.0～20.0 mg/mL外，整體均隨著蛋白濃度的增加而顯著增強(qiáng)，當(dāng)濃度升至50.0 mg/mL時(shí)，還原力達(dá)到了1.775±0.004，是相同濃度下VC還原力的63.03%。在蛋白濃度為0～45.0 mg/mL時(shí)，牦牛乳酪蛋白酶解液對O2·的清除率隨著蛋白濃度的增加而顯著增強(qiáng)，濃度升至50.0 mg/mL時(shí)，酶解液的清除能力達(dá)到了46.02%±2.26%。

體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)灌胃30 d后，試驗(yàn)組小鼠體重及脾臟指數(shù)均高于對照組；試驗(yàn)組小鼠血清中的SOD活力、MDA含量、GSH-Px活力與對照組之間差異均顯著（P＜0.05）；試驗(yàn)組組間的SOD活力差異顯著（P＜0.05），MDA含量、GSH-Px活力差異不顯著。以上數(shù)據(jù)表明，試驗(yàn)組小鼠較對照組而言，體重及脾臟指數(shù)均有增加，說明牦牛乳酪蛋白酶解液對小鼠的生長及非特異性免疫有促進(jìn)作用；與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠血清中SOD活力與GSH-Px活力均有提升，MDA含量有一定程度的下降。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：牦牛乳酪蛋白酶解產(chǎn)物在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，為牦牛乳抗氧化功能產(chǎn)品的研究提供了理論依據(jù)，在天然抗氧化劑應(yīng)用中具有廣闊前景。