楊滿英，陳雪珍，朱蓉，謝婷，胡金輝

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一。研究表明，中醫(yī)藥制劑在改善乳腺癌患者癥狀、調(diào)控精神心理狀態(tài)等方面具有明顯的療效?？蛋⑸湟海ㄒ韵潞?jiǎn)稱“康艾”）作為臨床應(yīng)用廣泛的中藥抗腫瘤制劑[1]，藥物安全性及有效性明確，取得了較好的臨床效果。康艾是由人參、黃芪、苦參中有效組分制成的中藥制劑，其中最關(guān)鍵的成分是苦參素[1-3]?？鄥⑺赜址Q氧化苦參堿，有研究顯示，其能夠有效調(diào)節(jié)乳腺癌腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)乳腺癌的多藥耐藥、調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝水平等[4-5]，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的效果。Lin 等[6]研究用氧化苦參堿介導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞Bax 和Bcl-2 的表達(dá)，可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。臨床亦有報(bào)道康艾可有效治療乳腺癌[7-9]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討康艾治療乳腺癌的潛在作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 康艾注射液活性成分收集與篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（ TCMSP ， http://www.tcmsp.com/tcmsp.php ） 和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstarget prediction.ch/）檢索人參、黃芪、苦參的活性成分，獲取分子信息，包括活性成分的分子名稱、口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）等。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為條件篩選主要活性成分。

1.2 康艾注射液活性成分相關(guān)靶蛋白獲取

根據(jù)篩選得到的活性成分，在TCMSP 中點(diǎn)擊“ Related Targets ” ， 獲取成分的“ Targets Information”，得到該成分作用的靶蛋白名。在UniProt（http://www.uniprot.org/）中，使用UniProt KB 檢索功能，在檢索框中輸入靶蛋白名，檢索條件為“organism: homo sapiens”和“reviewed: yes”，獲取基因名稱和UniProt ID。

1.3 康艾注射液治療乳腺癌靶點(diǎn)收集

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（ http://www.genecards.org/ ） 和 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omin.org/），以“breast cancer”為關(guān)鍵詞檢索乳腺癌相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)信息，根據(jù)Relevance score≥9.67 篩選核心基因。借助R 語(yǔ)言，獲得康艾活性成分靶蛋白與乳腺癌靶蛋白的交集靶點(diǎn)。

1.4 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)建康艾治療乳腺癌的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，圖中以“節(jié)點(diǎn)”（node）表示活性成分和靶點(diǎn)基因，用“邊”（edge）表示兩者之間的關(guān)系，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以篩選其中較為重要的活性成分。

1.5 交集基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)篩選

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），點(diǎn)擊“Multiple Proteins”，限定物種為人，獲取交集基因的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)讀后設(shè)置置信度為0.9，隱藏孤立蛋白，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.6.1 軟件繪制交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，以節(jié)點(diǎn)degree 值反映基因作用大小，依據(jù)degree≥19 和介度中心性≥0.022，獲得核心靶點(diǎn)。

1.6 GO 功能與KEGG 通路富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)（http://metascape.org/）進(jìn)行分析，設(shè)置物種為“Homo Sapiens”，進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。

1.7 分子對(duì)接

為進(jìn)一步驗(yàn)證活性成分與蛋白靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，選取“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中degree值排前3 位的活性成分，與PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。 在 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）中下載靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)，保存為“.pdb”格式文件，在TCMSP 中下載化合物的“.mol2”格式文件。在AutoDock1.5.6 軟件中導(dǎo)入靶點(diǎn)和化合物的結(jié)構(gòu)文件，經(jīng)過(guò)去水、加氫、分配電荷等處理，運(yùn)用Grid 模塊設(shè)置蛋白原配體為對(duì)接盒子中心，將準(zhǔn)備好的蛋白文件、配體文件、化合物文件及腳本放入相應(yīng)文件夾，利用AutodockVina1.1.2 分子模擬軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并使用Discovery Studio（2016 版）繪制最佳匹配結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1 康艾注射液活性成分及治療乳腺癌靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TCMSP 和SwissTargetPrediction 及相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充檢索，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為條件篩選得到黃芪、人參、苦參活性成分共43 個(gè)，其中黃芪20 個(gè)、人參22 個(gè)，苦參1 個(gè)，見表1。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)選取活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，其中共有22 個(gè)活性成分未能查到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因，刪除重復(fù)項(xiàng)目后獲得靶點(diǎn)295 個(gè)。通過(guò)GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)收集到乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)并篩選核心基因共3670個(gè)，將康艾和乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射并取交集得到204 個(gè)交集靶點(diǎn)，即康艾治療乳腺癌的潛在作用靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 康艾-乳腺癌基因靶點(diǎn)韋恩圖

表1 康艾注射液活性成分基本信息

續(xù)表1

2.2 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape3.6.1 軟件繪制康艾治療乳腺癌的中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖可直觀反映康艾通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)治療乳腺癌的作用機(jī)制。運(yùn)用CytoNCA 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)degree 排序，主要活性成分有氧化苦參堿、槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素、常春藤皂苷元、佳羅醇等。

圖2 康艾注射液治療乳腺癌中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將交集基因上傳至STRING，設(shè)置信度為高置信度（0.9），得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.6.1 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，見圖3。網(wǎng)絡(luò)圖中包含 174 個(gè)節(jié)點(diǎn)、853 條邊，使用“network analyzer”功能計(jì)算degree 值，用CytoNCA 對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)degree 值大小排序，顏色越深，節(jié)點(diǎn)越大，說(shuō)明該靶點(diǎn)在治療中的作用越大。排名前5 位的靶點(diǎn)分別為MAPK1、AKT1、JUN、TP53（即P53）、 ESR1。

圖3 康艾注射液治療乳腺癌作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 功能富集分析

將204 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)進(jìn)行生物過(guò)程（Biological Process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）富集分析。GO 功能富集分別得到BP、CC、MF 各10 項(xiàng)（見圖4），BP 主要涉及對(duì)毒性物質(zhì)的應(yīng)答（response to toxic substance）、細(xì)胞脂質(zhì)反應(yīng)（cellular response to lipid）、脂多糖反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）等，CC 有膜筏（membrane raft）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（transcription factor complex）等，MF 有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、蛋白結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合（protein domain specific binding）等。

圖4 康艾注射液治療乳腺癌靶點(diǎn)GO 功能富集分析

2.5 KEGG 通路富集分析

將上述204 個(gè)交集靶點(diǎn)在Metascape 平臺(tái)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，獲得康艾治療乳腺癌的20 條信號(hào)通路，其中關(guān)鍵通路有TNF 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、鉑類藥物耐藥信號(hào)通路、腫瘤糖代謝、細(xì)胞衰老、JAK-STAT 信號(hào)通路、FOXO 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。見圖5。

圖5 康艾注射液治療乳腺癌靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析

2.6 分子對(duì)接

根據(jù)度值、介度中心性從PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選得到排名前 5 位核心靶點(diǎn) MAPK1、AKT1、JUN、TP53、ESR1 作為治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)，與中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3 位的活性成分氧化苦參堿（oxymatrine）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）進(jìn)行分子對(duì)接，評(píng)分見圖6；分子對(duì)接結(jié)合能＜-5 時(shí)，認(rèn)為藥物和靶點(diǎn)蛋白結(jié)合穩(wěn)定，可起到治療作用。靶點(diǎn)蛋白和化合物的結(jié)合能均小于-5，表明受體和配體結(jié)合能力高。Vina Score 評(píng)分顯示山柰酚、氧化苦參堿和JUN 靶點(diǎn)結(jié)合能最低，說(shuō)明山柰酚、氧化苦參堿和JUN 的結(jié)合活性最強(qiáng)；槲皮素的最佳結(jié)合靶點(diǎn)是MAPK1，見圖7～圖9。

圖6 分子對(duì)接Vina Scroe 熱圖

圖7 槲皮素-MAPK1 分子對(duì)接模型及受體-蛋白質(zhì)2D 結(jié)合圖

圖7 山柰酚-JUN 分子對(duì)接模型及受體-蛋白質(zhì)2D 結(jié)合圖

圖8 氧化苦參堿-JUN 分子對(duì)接模型及受體-蛋白質(zhì)2D 結(jié)合圖

3 討論

隨著對(duì)乳腺癌發(fā)病及治療相關(guān)機(jī)制的研究不斷深入，其病理機(jī)制逐漸被揭示?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺癌的形成機(jī)制包括腫瘤雌激素受體機(jī)制、干細(xì)胞形成機(jī)制及炎性刺激相關(guān)機(jī)制等。在治療方面，較長(zhǎng)時(shí)間的西藥治療易出現(xiàn)各類臨床不良反應(yīng)且易復(fù)發(fā)。隋代醫(yī)家巢元方有云：“積聚者，由寒氣在內(nèi)所生也。血?dú)馓撊酰L(fēng)邪搏于腑臟，寒多則氣澀，氣澀則生積聚也?！薄夺t(yī)宗必讀?積聚》記載“積之成者，正氣不足，而后邪氣居之”。乳腺癌在中醫(yī)又稱為“乳巖”“乳石癰”“翻花乳”等。中醫(yī)認(rèn)為乳腺癌的病機(jī)以氣血虧虛為本，氣滯血瘀、痰火毒結(jié)為標(biāo)，整體屬虛，局部屬實(shí)，虛實(shí)夾雜[10]。手術(shù)治療易內(nèi)耗氣血，致氣血更虧；化療、放療更為攻伐之術(shù)，驅(qū)邪同時(shí)也損傷正氣，灼傷陰津。故中醫(yī)治療時(shí)多以扶正祛邪為治療大法，兼顧養(yǎng)陰?？蛋哂幸鏆怵B(yǎng)陰、扶正抗癌的作用，初始研究多用以治療肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、婦科相關(guān)惡性腫瘤，或化療后導(dǎo)致的骨髓抑制、白細(xì)胞減少癥；從中醫(yī)辨證論治角度看，康艾配方基礎(chǔ)契合乳腺癌“益氣養(yǎng)陰、扶正抗癌”的治療原則，且近年來(lái)，臨床上把康艾擴(kuò)展運(yùn)用于治療手術(shù)后化療患者亦取得良好的臨床效果。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)狀式地闡述藥物有效成分與疾病各個(gè)靶點(diǎn)的內(nèi)在關(guān)系，這與中藥復(fù)方多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用原理不謀而合[11-13]。本研究分析顯示，康艾關(guān)鍵成分為氧化苦參堿、槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇、人參皂苷等成分起到協(xié)同作用。槲皮素、山柰酚屬于植物來(lái)源的黃酮類化合物，是一類具有抗癌活性且毒副作用小的天然多酚類化合物[14]。槲皮素、山柰酚抗乳腺癌機(jī)制包括阻滯細(xì)胞周期[15-18]、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19-21]、抑制侵襲轉(zhuǎn)移[22]、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖代謝[21,23]、化療增敏及逆轉(zhuǎn)耐藥[19,24-25]抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。氧化苦參堿不僅具有類黃酮類化合物的抗癌活性，還能誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生自噬[26]，但其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的自噬作用目前暫未見報(bào)道。

康艾治療乳腺癌主要作用蛋白為 MAPK1、AKT1、JUN、TP53、ESR1。MAPK1 屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，MAPK 在乳腺癌中被明顯激活，持續(xù)活化最終導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化。邵建斌等[27]體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，miR-198 靶向MAPK1 能抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究分子對(duì)接中3 種核心有效成分與MAPK1 結(jié)合活性僅次于最高結(jié)合點(diǎn)JUN，說(shuō)明康艾有效成分能穩(wěn)定結(jié)合在乳腺癌MAPK1 靶點(diǎn)上，起到治療作用。AKT1 又稱蛋白激酶B，是PI3K/AKT 信號(hào)通路中重要的下游靶標(biāo)，參與的生物過(guò)程包括調(diào)控細(xì)胞存活、代謝、生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成。Li等[28]研究表明，大黃素干擾AKT1 介導(dǎo)的DNA 損傷并降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。Capivasertib（AZD5363）是一個(gè)高選擇性的AKT1-3 亞型抑制劑，一項(xiàng)雙盲、隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，Capivasertib 聯(lián)合紫杉醇治療三陰性乳腺癌，其治療效果使無(wú)進(jìn)展生存期增加1 倍以上，且顯著提高客觀緩解率和總生存期[29]。JUN 屬于激活蛋白（AP-1）的蛋白家族之一，當(dāng)受到細(xì)胞張力變化、DNA損傷、氧化應(yīng)激、紫外線照射、細(xì)菌及病毒感染等刺激時(shí)，活化后的AP-1 作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物過(guò)程。Song 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，AP-1 在三陰性乳腺癌中高表達(dá)，靶向阻斷AP-1 家族蛋白成員可增加三陰性乳腺癌患者對(duì)PARP 抑制劑的敏感性。癌癥患者對(duì)化療藥物不敏感或耐藥是臨床治療重大難題之一，康艾關(guān)鍵有效成分氧化苦參堿、槲皮素、山柰酚均被證實(shí)具有化療增敏及逆轉(zhuǎn)耐藥的作用[4,15,31]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，氧化苦參堿、山柰酚與JUN 有最佳的對(duì)接結(jié)果，說(shuō)明康艾不僅有抗乳腺癌效果，聯(lián)合化療藥還起到化療增敏及減少耐藥的作用，與多項(xiàng)臨床觀察實(shí)驗(yàn)[7,9]得出結(jié)論一致。突變后的P53 失去原有的抑癌功能，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)失去調(diào)控作用，Rong 等[32]對(duì)958 例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的血液標(biāo)本進(jìn)行ctDNA 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)突變腫瘤基因P53 約54%，P53 與較差的臨床結(jié)局相關(guān)。

GO 功能富集分析顯示，康艾干預(yù)乳腺癌細(xì)胞膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體。膜筏主要生物功能有信息傳導(dǎo)、膜組分分迭、腺癌細(xì)胞的定向遷移等[33]。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤預(yù)后及總生存（OS）的關(guān)鍵因素，細(xì)胞外基質(zhì)是阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的重要組織屏障，一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)分析表明，MMP2、MMP9 過(guò)度表達(dá)與不良OS 相關(guān)，細(xì)胞外基質(zhì)在癌癥患者生存期發(fā)揮重要角色[34]。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)作用，陸慧敏等[35]研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可激活A(yù)P-1，對(duì)4T1 乳腺癌模型小鼠有抑制作用。說(shuō)明康艾治療乳腺癌可能和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)相關(guān)通路靶點(diǎn)的調(diào)控相關(guān)。

KEGG 通路富集分析顯示，MAPK 信號(hào)通路起到主要作用。通路之間相互交叉，又相互作用，其治療特點(diǎn)是在乳腺癌通路網(wǎng)路上多位點(diǎn)阻滯或激活，相比單一靶點(diǎn)的藥物，或許能得到更好的療效。

綜上所述，本研究揭示了康艾治療乳腺癌的主要活性成分為氧化苦參堿、槲皮素、山柰酚，涉及的關(guān)鍵分子功能有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、蛋白結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，其參與的作用機(jī)制主要與MAPK 通路相關(guān)，提示康艾治療乳腺癌有效物質(zhì)-關(guān)鍵靶點(diǎn)作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，為進(jìn)一步的藥效物質(zhì)研究及作用機(jī)制研究提供方向。

本研究仍存在不足之處，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得到的有效成分及靶點(diǎn)均從數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配信息得到，但目前現(xiàn)有的中藥數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)收集藥物的信息存在差異性，代謝分布不統(tǒng)一，中藥的生物利用度、組織分布等無(wú)法客觀量化等，因此本研究下一步將依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的藥物物質(zhì)基礎(chǔ)和通路展開實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究。