項(xiàng) 玲, 肖桂然

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease,HD)是一種常染色體顯性遺傳神經(jīng)退行性疾病,以舞蹈樣不自主動(dòng)作[1]和進(jìn)行性智能衰退為特征[2]。臨床上主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知及精神3個(gè)方面的障礙而且進(jìn)行性加重,發(fā)病年齡從童年到大于70歲不等,患者一般在中年(35～50歲)發(fā)病,發(fā)病后15～20 a后死亡[3-4]。但是到目前為止其致病機(jī)理仍不明確,并且尚無(wú)有效的治療手段,目前主要治療策略仍為對(duì)癥治療,包括減輕運(yùn)動(dòng)癥狀、改善認(rèn)知功能、調(diào)整異常精神狀態(tài)等[5]。

HD致病基因?yàn)镮T15,代謝產(chǎn)物為亨廷頓蛋白(Huntingtin,Htt),Htt氨基端從第17位氨基酸殘基開(kāi)始有一段重復(fù)的谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)序列。該重復(fù)序列過(guò)度延長(zhǎng)形成異常的享廷頓蛋白,會(huì)在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)聚集、沉淀,該現(xiàn)象被認(rèn)為是該病發(fā)病的原因和關(guān)鍵[6]。它的長(zhǎng)度在正常人群中短于36個(gè),而在HD患者中突變的Htt的谷氨酰胺序列長(zhǎng)度超過(guò)37個(gè)[7]。該疾病的發(fā)生和嚴(yán)重程度取決于polyQ片段的長(zhǎng)度,polyQ片段越長(zhǎng),疾病開(kāi)始得越早、病情越嚴(yán)重[8-9]。盡管近年來(lái)國(guó)際上對(duì)HD的研究非?；钴S,但Htt突變后引起神經(jīng)元死亡的分子機(jī)制尚不清楚[10-11]。研究發(fā)現(xiàn),雖然整個(gè)亨廷頓蛋白分子量為350 kDa,但實(shí)際上含有polyQ的亨廷頓蛋白在體內(nèi)需要被剪切成短的N端片段才能發(fā)揮毒性,而且病人腦中具有很多被截短的N端毒性片段,其中這些片段中大部分是exon1片段[10-11]。

有研究發(fā)現(xiàn)，多種神經(jīng)退行性疾病患者腦內(nèi)有過(guò)渡金屬離子的失衡現(xiàn)象,包括鋅離子、鐵離子、銅離子和錳離子等。文獻(xiàn)[12-14]表明,HD和金屬的關(guān)系密切,病人和小鼠、大鼠模型腦中都發(fā)現(xiàn)鐵離子和銅離子的異常升高;文獻(xiàn)[15]表明銅離子能夠促進(jìn)體外表達(dá)的亨廷頓致病蛋白 N 端片段聚集。本課題組前期利用果蠅模型研究發(fā)現(xiàn),腦內(nèi)銅離子水平直接影響HD的進(jìn)程[11]。課題組利用生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn),亨廷頓蛋白第1個(gè)外顯子(Htt-exon1)上存在可能與金屬離子結(jié)合的位點(diǎn),但是沒(méi)有直接證據(jù)[16]。

本課題組從Htt-exon1入手,通過(guò)基因工程手段得到體外表達(dá)的GST融合蛋白GST-Htt-exon1,借助于GST標(biāo)簽,將此蛋白分離純化成功,得到純化的Htt-exon1,并且進(jìn)一步借助于電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)技術(shù)檢測(cè)其與銅離子的結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠與銅離子直接結(jié)合。本文推測(cè)銅離子在體內(nèi)通過(guò)直接與該致病蛋白結(jié)合促進(jìn)其聚集,加重其毒性,促進(jìn)疾病進(jìn)程。該研究對(duì)于探究該致病蛋白產(chǎn)生毒性的分子機(jī)制至關(guān)重要,為后續(xù)疾病的防治及藥物靶點(diǎn)的尋找奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌和載體

大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α、DE3購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司; pGEX-6p-2載體由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周兵實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑

EasyTaq DNA Polymerase、BamHⅠ和HindⅢ限制性快速內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase buffer、dNTP mix、Trans2K Plus DNA Marker、T4 DNA Ligase、6×DNA loading buffer、蛋白Marker、5×Protein loading buffer、無(wú)菌水等均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;GST重力預(yù)裝柱購(gòu)自 Novagen 公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、氨芐青霉素、考馬斯亮藍(lán)R-250、瓊脂糖、TAE、溴化乙錠均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司;GST Bind Resin 和填料柱購(gòu)于Novagen 公司;PVDF 膜購(gòu)于Millipore 公司;顯色試劑購(gòu)于碧云天公司。引物合成及序列測(cè)定由上海生工生物工程股份有限公司完成;ICP-MS由清華大學(xué)分析測(cè)試中心完成。

1.1.3 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)于北京勤誠(chéng)盛達(dá)科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超凈工作臺(tái)購(gòu)于上海智城分析儀器制造有限公司;高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于Beckman Coulter,USA;超低溫冰箱購(gòu)于Thermo Fisher scientific;凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于上海天能科技有限公司;基因擴(kuò)增儀、恒溫培養(yǎng)振蕩器、脫色搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物如下。

上游引物 F:

5′-ATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAG-3′;

下游引物R:

5′-CGGTCGGTGCAGCGGCTCCTCAG-3′。

選用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ2個(gè)酶切位點(diǎn)。 以含有42個(gè)polyQ的Htt-exon1 polyQ42 轉(zhuǎn)基因果蠅P463及對(duì)照[17]的cDNA為模板,通過(guò) PCR 擴(kuò)增、雙酶切、凝膠回收后連接到載體pGEX-6p-2上構(gòu)成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞, 挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行 PCR 和測(cè)序鑒定。借助于PCR過(guò)程中CAG的高度重復(fù),獲得含有10個(gè)polyQ的Htt-exon1 polyQ10和含有42個(gè)polyQ的毒性蛋白Htt-exon1 polyQ42共2種片段。

1.2.2 重組蛋白的原核表達(dá)

將測(cè)序后鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中,配制 LB 液體培養(yǎng)基,挑選陽(yáng)性單克隆接種到含有 LB 液體培養(yǎng)基的1.5 mL EP 管過(guò)夜,第 2天 早上轉(zhuǎn)接到 10 mL LB 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng),培養(yǎng)至OD600達(dá)到 0.4 ～0.6 時(shí),加IPTG 至終濃度為 0.5 mmol/L,18 ℃誘導(dǎo)14 h,25 ℃誘導(dǎo)7 h,離心收集菌體,超聲破碎菌體獲取上清。SDS-PAGE 電泳檢測(cè)表達(dá)結(jié)果,比較不同條件下表達(dá)菌表達(dá)的蛋白量。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)

12 000 r/min、10 min離心收集菌體, Tris-HCl 洗滌菌體,將樣品置于冰上,超聲破碎至樣品清亮。先留取一部分全蛋白,然后在12 500 r/min條件下離心20 min,離心后分別留上清液和沉淀。用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 重組蛋白的純化

利用帶有GST的標(biāo)簽蛋白與瓊脂糖介質(zhì)上交聯(lián)的谷胱甘肽配體互補(bǔ)性結(jié)合,用上清液注到柱子上進(jìn)行純化,重組蛋白。利用蛋白酶PP在其位點(diǎn)進(jìn)行特異性切割,收集切割后純化的蛋白液。用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行蛋白定量并且將全蛋白、上清液、沉淀及純化后的重組蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.5 Western Blot 鑒定

按1.2.4 所述方法分離純化得到的Htt-exon1 polyQ10、Htt-exon1 polyQ42與轉(zhuǎn)空載體的 BL21 裂解上清液進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)膜,用 5% 脫脂奶粉 4 ℃封閉過(guò)夜,加入用 PBST(PBS緩沖鹽-0.5%吐溫20)溶液稀釋的鼠 ANTI-Htt-exon1 一抗(Sigma, 3B5H10),室溫輕搖 2 h,PBST 洗膜 3 次,每次 5 min;加入羊抗鼠IgG (BOSTER,BA1031),室溫輕搖 2 h,PBST 洗膜 3 次,每次 5 min;顯色液顯色,觀察 PVDF 膜上的顯色條帶。

1.2.6 重組蛋白與銅離子的結(jié)合能力檢測(cè)

按 1.2.4 所述方法分離純化得到Htt-exon1 polyQ10和Htt-exon1 polyQ42,將蛋白樣品硝化溶解于 15% 稀硝酸中,采用ICP-MS測(cè)定銅離子的質(zhì)量濃度。每個(gè)樣品重復(fù) 3 次,數(shù)據(jù)用 Graph Pad Prism 6.0 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Htt表達(dá)載體的構(gòu)建分析

以cDNA為模板擴(kuò)增Htt-exon1 polyQ,樣品PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的特異性條帶,結(jié)果顯示,擴(kuò)增片段條帶清晰、大小正確,與Htt-exon1片段相符,初步推斷已擴(kuò)增出目的基因片段。用限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ切割目的基因和pGEX-6p-2載體,酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),如圖1所示。圖1中,M代表marker;1、2分別代表Htt-exon1 polyQ10的PCR擴(kuò)增條帶及酶切條帶;3、4分別代表Htt-exon1 polyQ42的PCR擴(kuò)增條帶及酶切條帶。

圖1 擴(kuò)增片段及酶切回收后的電泳檢測(cè)

將酶切過(guò)的基因和載體用T4 DNA連接酶于16 ℃金屬浴中過(guò)夜連接,得到重組質(zhì)粒pGEX-6p-2 Htt-exon1 polyQ,如圖2所示。

圖2 重組質(zhì)粒 pGEX-6p-2 Htt-exon1 polyQ的結(jié)構(gòu)示意圖

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入克隆載體E.coliDH5α,用含有100 g/L氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性單克隆,結(jié)果如圖3所示,由圖3可知,大腸桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形,表面光滑,半透明,小凸起?？梢耘袛嗥桨迳仙L(zhǎng)的是大腸桿菌,且未被雜菌污染。

圖3 轉(zhuǎn)化后的克隆載體DH5α

挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并進(jìn)行電泳檢測(cè),鑒定結(jié)果如圖4所示。圖4中，M代表marker。由圖4可知，挑選的部分單菌落為陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增后條帶大小不一致,這是由于Htt-exon1中含有大量CAG重復(fù),在擴(kuò)增的過(guò)程中會(huì)有變化,導(dǎo)致不同長(zhǎng)度的CAG重復(fù)數(shù)目產(chǎn)生,本文利用這一原理,在一個(gè)模板的幫助下,獲取不同長(zhǎng)度的Htt-exon1 polyQ。

圖4 菌落PCR的電泳圖

2.2 GST-Htt exon1 polyQ的原核表達(dá)分析

將陽(yáng)性克隆的重組質(zhì)粒提取出來(lái)并轉(zhuǎn)入到表達(dá)載體E.coliBL21,對(duì)表達(dá)菌進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化效果良好。

加入誘導(dǎo)劑IPTG 25 ℃誘導(dǎo)7 h,讓菌株表達(dá)目的蛋白,比較不同條件下表達(dá)菌表達(dá)的蛋白量。對(duì)細(xì)菌表達(dá)的蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色實(shí)驗(yàn),對(duì)表達(dá)菌表達(dá)的蛋白進(jìn)行定性檢測(cè),結(jié)果如圖5所示。圖5中:M代表marker;1代表未誘導(dǎo)蛋白;2代表GST標(biāo)簽;黑色方框中表示表達(dá)的Htt-exon1 polyQ10和Htt-exon1 polyQ42,分別記為3、4。

由圖5可知,由蛋白質(zhì)marker對(duì)照得知,GST標(biāo)簽分子量為27 kDa,GST-Htt-exon1 polyQ10的分子量為40 kDa左右,GST-Htt-exon1 polyQ42的分子量為50 kDa左右。

圖5 不同誘導(dǎo)條件下考馬斯亮藍(lán)染色

2.3 GST-Htt-exon1 polyQ的純化結(jié)果分析

將樣品破碎取全蛋白上清液、沉淀與過(guò)柱子之后的洗脫液進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色分析, 利用帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白與瓊脂糖介質(zhì)上交聯(lián)的谷胱甘肽配體互補(bǔ)性結(jié)合,除雜后加入還原型谷胱甘肽洗脫蛋白,從而分離到純化目的蛋白，結(jié)果如圖6所示。

圖6 GST融合蛋白純化過(guò)程中樣品的電泳檢測(cè)

圖6中:1～7為表達(dá)的Htt-exon1 polyQ10;8～14為表達(dá)的Htt-exon1 polyQ42；M代表marker。1和8分別為全蛋白樣品;2和9分別為上清液樣品;3和10分別為沉淀樣品;4和11分別為上清上柱后的流傳液,說(shuō)明表達(dá)的蛋白都結(jié)合到吸附柱了,吸附效果良好;5和12分別為GST對(duì)照上柱之后的流傳液,說(shuō)明吸附效果良好;6和13分別為加入還原型谷胱甘肽洗脫蛋白,分離純化的目的蛋白,6為帶有GST標(biāo)簽的Htt-exon1 polyQ10,13為帶有GST標(biāo)簽的Htt-exon1 polyQ42;7和14 為吸附了表達(dá)蛋白后的柱子內(nèi)的瓊脂糖介質(zhì),說(shuō)明吸附效果良好,切割效果良好,洗脫下來(lái)的蛋白中含有切割完成后吸附在柱子上的GST,沒(méi)有切割的仍舊吸附在柱子上的有GST標(biāo)簽的Htt-exon1 polyQ10和有GST標(biāo)簽的Htt-exon1 polyQ42。帶有GST標(biāo)簽Htt-exon1 polyQ10的大小為50 kDa,帶有GST標(biāo)簽Htt-exon1 polyQ42的大小為54 kDa。圖6結(jié)果表明，融合了GST標(biāo)簽的Htt-exon1 polyQ10 和Htt-exon1 polyQ42在GST的幫助下順利被分離純化。

2.4 純化后重組蛋白Western Blot驗(yàn)證

用 GST 親和層析柱純化后的蛋白洗脫液,經(jīng)PP酶切割后,利用SDS-PAGE分析后發(fā)現(xiàn)皆可得到純度相對(duì)較高的目的蛋白。然后將純化后的蛋白進(jìn)行 Western Blot 鑒定,結(jié)果如圖 7所示。圖7中:1代表Htt-exon1 polyQ42;2代表Htt-exon1 polyQ10。由圖7可知,Htt-exon1 polyQ10在 8.5 kDa 位置出現(xiàn)了一條明顯的條帶,Htt-exon1 polyQ42在 12.5 kDa 位置出現(xiàn)了一條明顯的條帶,與預(yù)測(cè)的蛋白大小的位置相符。

圖7 Western Blot 鑒定純化后的重組蛋白

2.5 重組蛋白與銅離子結(jié)合能力的分析

在誘導(dǎo)過(guò)程中,向培養(yǎng)基中外源添加銅離子后分離純化融合蛋白,運(yùn)用BCA kit檢測(cè)蛋白濃度,運(yùn)用 ICP-MS 檢測(cè)蛋白上銅離子的質(zhì)量濃度,結(jié)果如圖8所示。

圖8 ICP-MS 測(cè)得重組蛋白中銅離子質(zhì)量濃度

從圖8可以看出，Htt-exon1 polyQ10和Htt-exon1 polyQ42上均結(jié)合了大量的銅離子,作為對(duì)照的EGFP蛋白沒(méi)有與銅離子的結(jié)合,這說(shuō)明Htt-exon1能夠直接結(jié)合銅離子,且不受polyQ濃度的影響。

3 結(jié) 論

HD是一種由于polyQ過(guò)度延長(zhǎng)引起的神經(jīng)退行性疾病,該疾病是世界上第三大神經(jīng)退行性疾病,影響很多人的健康。但是由于該疾病病因、病理一直不明確,目前缺少有效治療手段。HD病人及疾病模型動(dòng)物體內(nèi)均有銅離子的紊亂,但是具體機(jī)制不明。本課題組一直致力于銅離子與HD的研究。前期利用果蠅模型研究發(fā)現(xiàn),腦內(nèi)銅離子會(huì)促進(jìn)致病蛋白Htt-exon1 polyQ的聚集,促進(jìn)疾病進(jìn)程,降低腦內(nèi)銅離子水平能夠顯著挽救HD模型的疾病表型[11]。但是銅離子促進(jìn)Htt-exon1 polyQ聚集的分子機(jī)制卻不清楚。

本文利用基因克隆技術(shù)獲得致病蛋白片段Htt-exon1 polyQ,并于大腸桿菌中成功表達(dá);利用GST標(biāo)簽分離純化該蛋白,研究發(fā)現(xiàn)體外表達(dá)的Htt-exon1 polyQ蛋白具有結(jié)合銅離子的能力。提供了直接的證據(jù)表明HD致病蛋白片段具有結(jié)合銅離子的能力,證實(shí)了之前提出的假設(shè),銅離子通過(guò)直接結(jié)合到Htt-exon1上,引起Htt-exon1 polyQ的構(gòu)象變化,從而影響其毒性。對(duì)研究該疾病的致病機(jī)理及藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和疾病的治療具有十分重要的意義。

在本文構(gòu)建的純化蛋白基礎(chǔ)上,可以深入探究該致病蛋白的性質(zhì)及結(jié)構(gòu),以研究該蛋白致病機(jī)制,為HD尋找治療手段。例如,可以探測(cè)在體外條件下,影響該蛋白聚集的條件,包括金屬離子、氧化壓力、環(huán)境等;可以探究能夠緩解致病蛋白聚集的條件;可以篩選與該蛋白存在互作的蛋白,深入剖析蛋白在體內(nèi)的作用機(jī)制及代謝過(guò)程;可以進(jìn)行藥物篩選,尋找能夠緩解致病蛋白聚集的藥物。