王循剛，張曉玲，2，徐田偉，耿遠(yuǎn)月，2，胡林勇，趙娜，劉宏金，康生萍，2，徐世曉*

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

瘤胃作為反芻動物重要的厭氧發(fā)酵器官，生活著大量的厭氧微生物，包括細(xì)菌、真菌、古菌，以及原蟲等［1-2］。反芻動物攝入淀粉、蛋白質(zhì)、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)后，通過瘤胃微生物的發(fā)酵分解產(chǎn)生大量的能量，對機(jī)體的健康維持起著重要的作用。研究表明，反芻動物瘤胃微生物區(qū)系受到年齡、遺傳、飼糧等多個因素的影響［3-5］。不同類型的飼糧會使進(jìn)入瘤胃的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生差異，影響瘤胃的發(fā)酵類型，進(jìn)一步影響其營養(yǎng)代謝速率。蛋白質(zhì)作為動物飼糧中重要的營養(yǎng)素之一，是一切生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，對動物的生長發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用。瘤胃微生物在飼糧中蛋白質(zhì)降解的過程中會產(chǎn)生大量的氨，為其合成微生物蛋白質(zhì)提供必需的氮源，以此為機(jī)體提供蛋白質(zhì)，促進(jìn)生長發(fā)育［6］。藏系綿羊作為青藏高原的特有畜種，生活在海拔3000 m以上，對青藏高原嚴(yán)酷的高寒環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性［7］。前人對藏系綿羊的營養(yǎng)學(xué)研究主要集中在不同飼糧類型對其生長性能、發(fā)酵參數(shù)和屠宰性能等的影響，對于其瘤胃微生物的研究僅局限于瘤胃細(xì)菌菌群［8-11］，而對于瘤胃真菌菌群的研究鮮有報(bào)道。雖然瘤胃真菌的生物量僅僅占瘤胃微生物總量的8%，但是能夠更大程度地對飼糧中的可溶性多糖和纖維素等營養(yǎng)物質(zhì)起到降解作用［12］。因此，了解藏系綿羊瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)和功能對于豐富高寒家畜瘤胃微生物學(xué)研究以及高寒適應(yīng)性研究具有重要的科學(xué)意義。高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展應(yīng)用，為研究反芻動物瘤胃微生物多樣性提供了極大的便利。本研究在探討飼糧蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊生長性能影響的基礎(chǔ)上，以真菌ITS1高變區(qū)作為分子標(biāo)記，利用Illumina高通量測序技術(shù)對藏系綿羊瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)組成和多樣性進(jìn)行探究，以此為藏系綿羊的健康養(yǎng)殖和相關(guān)營養(yǎng)學(xué)研究提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2019年1-4月在青海省海北高原現(xiàn)代生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園（N 100°57′06″，E 36°55′05″）進(jìn)行。試驗(yàn)選取18只12月齡健康、平均體重為（31.71±0.72）kg的藏系綿羊羯羊?yàn)樵囼?yàn)動物，隨機(jī)分為3個處理組，每組6個重復(fù)。根據(jù)NRC（2007）和中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）配制3種代謝能（metabolizable energy，ME）相近而蛋白質(zhì)（crude protein，CP）含量不同的飼糧，其代謝能約為10.1 MJ·kg-1，蛋白質(zhì)含量分別為10.06%（LP）、12.10%（MP）和14.12%（HP），飼糧組成及營養(yǎng)水平詳見表1。飼養(yǎng)試驗(yàn)開始前對藏系綿羊進(jìn)行驅(qū)蟲處理，對圈舍及飼喂器具進(jìn)行清潔消毒。飼養(yǎng)過程中藏系綿羊每天飼喂兩次（8：00和17：00），單欄飼喂，飼喂量為活體重的3.5%，期間自由飲水。試驗(yàn)正試期開始和結(jié)束時分別對藏系綿羊進(jìn)行稱重，計(jì)算平均日增重（average daily gains）。每天晨飼前收集前一天的剩料，準(zhǔn)確記錄平均日采食量（average daily feed intakes）。以平均日采食量和平均日增重之比作為料重比（feed conversion ratio，F(xiàn)/G）。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutr ient levels of diets（dry matter basis）

1.2 瘤胃液樣品的采集及處理

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時，采用瘤胃管法抽取藏系綿羊的瘤胃液。采集瘤胃液時打開羊的口腔，將瘤胃管從羊口腔緩慢插入，注射器抽取瘤胃內(nèi)容物約50 mL，后用4層紗布過濾，將過濾后的瘤胃液裝入凍存管編號后立即投入液氮中保存。所有樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80℃條件下保存，待測。

1.3 微生物DNA提取及高通量測序

取200 mg瘤胃液樣品，采用CTAB方法對樣品的總DNA進(jìn)行提取。以樣品提取的總DNA為模板對真菌ITS1高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為：F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），反應(yīng)體系為30μL：Phusion Master Mix（2×）15μL，正向引物（2μmol）1.5μL，反向引物（2μmol）1.5μL，模板DNA 10μL，H2O 2μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：98℃預(yù)變性1 min；隨后變性循環(huán)30次（98℃，10 s；50℃，30 s；72℃，30 s）；72℃延伸5 min，4℃冷卻，PCR產(chǎn)物檢測合格后使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收。采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺對DNA片段進(jìn)行高通量測序，獲得原始測序數(shù)據(jù)后再進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.4 生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

得到原始數(shù)據(jù)后，為了使后續(xù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果更加可靠、準(zhǔn)確，避免一定比例的干擾數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接過濾，得到優(yōu)化序列。使用Uparse軟件根據(jù)相似度為97%的原則對序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類。根據(jù)OTU聚 類 的 結(jié) 果，利 用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每個OTU的代表性序列進(jìn)行物種注釋并得到相應(yīng)的物種信息及物種豐度分布情況。計(jì)算每個樣本的Alpha多樣性和Beta多樣性。Alpha多樣性由反映群落豐富度的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)，反映群落多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)進(jìn)行評估。式中，Chao1指數(shù)的計(jì)算公式為：Schao1=Sobs+n1（n1-1）/2（n2+1），式中：Sobs是觀察到的物種數(shù)，n1是只有1條序列的物種數(shù)，n2是只有2條序列的物種數(shù)；ACE指數(shù)的計(jì)算方法參照https://mothur.org/wiki/ace/中的描述；Shannon指數(shù)的計(jì)算公式為：H=-∑PilnPi；Simpson指數(shù)的計(jì)算公式為：D=1-∑Pi2，式中：Pi是第i個物種所占的百分比。Beta多樣性選擇利用非加權(quán)遺傳距離矩陣（unweighted unifrac distance）計(jì)算，并進(jìn)行PCoA的可視化分析。將Unite數(shù)據(jù)庫（http://unite.ut.ee/index.php）得到的物種注釋結(jié)果進(jìn)行不同分類水平上的群落組成分析，并進(jìn)行柱狀圖和熱圖的可視化展示。使用LEfSe（linear discriminant analysis effect size）在線分析工具（http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/）進(jìn)行LEfSe分析，以線性判別分析的LDA值（LDA score>3）作為篩選條件尋找組間在豐度上有顯著差異的物種。使用FUNGuid對菌群進(jìn)行基因功能預(yù)測分析，并根據(jù)功能分類豐度進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和功能豐度熱圖的繪制。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和Duncan法多重比較檢驗(yàn)，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊生長性能的影響

由表2可知，各組間藏系綿羊的初始體重?zé)o顯著差異（P>0.05）。試驗(yàn)結(jié)束時，LP組的終末體重、平均日增重和平均日采食量均顯著低于MP組和HP組（P<0.05），而料重比顯著高于MP組和HP組（P<0.05）。

表2 飼糧蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊生長性能的影響Table 2 Effects of dietary protein levels on growth performance of Tibetan sheep

2.2 飼糧蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊瘤胃真菌菌群多樣性的影響

2.2.1 藏系綿羊瘤胃真菌菌群Alpha多樣性分析 基于Illumina Nova測序平臺對藏系綿羊18個瘤胃液樣品進(jìn)行ITS高通量測序，共獲得1654534條原始序列（raw tags），平均每個樣品測得91919條，原始序列經(jīng)過質(zhì)控后獲得有效序列（clean tags）1547415條，平均每個樣品85968條，每條序列平均長度為240.5 bp，質(zhì)控有效率達(dá)69.89%。各樣品的稀釋曲線均趨于平緩（圖1A），說明本試驗(yàn)測序所得數(shù)據(jù)量已經(jīng)覆蓋樣本中的絕大多數(shù)物種，滿足后續(xù)微生物多樣性分析條件。以97%的一致性原則將序列聚類成OTUs（operational taxonomic units）（圖1B），共得到4073個OTUs，其中LP組2650個，MP組1872個，HP組2080個，3組共享983個OTU，占總OTU數(shù)量的24.13%。飼糧蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊瘤胃真菌菌群Alpha多樣性分析結(jié)果如表3所示，不同處理組間瘤胃真菌菌群的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)及Chao 1指數(shù)差異均不顯著（P>0.05）。

表3 飼糧蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊瘤胃真菌菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effects of dietary protein levels on Alpha diversity index in rumen fungi flora of Tibetan sheep

圖1 樣品稀釋曲線和OTU韋恩圖Fig.1 Rarefaction curve of sample（A）and OTUs Venn diagram（B）

2.2.2 藏系綿羊瘤胃真菌菌群Beta多樣性分析為了探究飼糧蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊瘤胃真菌群落組成的影響，基于樣本的OTU信息，計(jì)算各樣本之間的非加權(quán)遺傳距離（unweighted genetic dis?tance），并進(jìn)行PCoA的可視化分析。結(jié)果如圖2所示，3個不同處理組的樣本分別聚類于不同的坐標(biāo)位置。其中LP組樣本與其余2組距離相隔較遠(yuǎn)，表明其真菌菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

圖2 基于非加權(quán)遺傳距離的PCoA分析Fig.2 PCoA analysis based on unweighted genetic distance

2.3 飼糧蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊瘤胃真菌菌群組成的影響

在不同分類水平上對測序所得的有效序列進(jìn)行物種注釋，共注釋到13個門、46個綱、117個目、244個科、489個屬和520個種。

由圖3可知，在門分類水平上，藏系綿羊瘤胃真菌的優(yōu)勢菌門主要為子囊菌門（51.06%～70.76%）、擔(dān)子菌門（3.78%～4.70%）、被孢霉亞門（0.21%～2.50%）、新 美 鞭 菌 門（0.29%～5.67%）、毛霉亞門（0.10%～3.92%）、羅茲菌門（0.05%～0.11%）和球囊菌門（0.05%～0.27%）等。其中，子囊菌門是占絕對優(yōu)勢的菌門。進(jìn)一步分析在屬分類水平上藏系綿羊瘤胃真菌的菌群組成，由圖4可知，優(yōu)勢菌屬主要為青霉屬（18.43%～37.58%）、無莖真菌屬（1.49%～5.93%）、枝孢屬（1.32%～4.27%）、鐮孢霉屬（0.65%～4.55%）、鏈格孢屬（0.89%～3.07%）和葡萄孢屬（0.69%～1.98%）等。分別對不同處理組間真菌優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬的相對豐度進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼糧蛋白質(zhì)水平并沒有對藏系綿羊瘤胃真菌的結(jié)構(gòu)組成造成顯著性影響（P>0.05）。

圖3 藏系綿羊瘤胃真菌門水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of rumen fungi flora of Tibetan sheep at phylum level

圖4 藏系綿羊瘤胃真菌屬水平相對豐度熱圖Fig.4 Heatmap of the relative abundance of rumen fungi flora of Tibetan sheep at genus level

2.4 瘤胃真菌差異物種分析

通過LEfSe對在各個分類水平上豐度有顯著差異的微生物進(jìn)行比較分析。如圖5所示，發(fā)現(xiàn)33個符合生物標(biāo)記物的真菌菌群（LDA score>3.0），其中LP組中有12個，包括盤菌目、盤菌綱、附球菌屬、Epicoccum_sorghinum等；MP組中有12個，包括座囊菌綱、Plectosphaerella、Plectosphaerellaceae、Lecanoromycetes等；HP組中有9個，包括麥角菌、麥角菌屬、被孢霉屬、豐屋菌屬等。

圖5 LEf Se分析柱狀圖Fig.5 Column chart for LEf Se analysis

2.5 瘤胃真菌功能預(yù)測分析

對藏系綿羊瘤胃真菌進(jìn)行功能注釋，并將數(shù)據(jù)庫功能注釋的豐度統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行PCA降維分析。如圖6A所示，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為31.59%和16.32%，且LP組樣品在聚類結(jié)果上與MP、HP兩組相對區(qū)分?；贔UNGuid預(yù)測藏系綿羊瘤胃真菌菌群的營養(yǎng)型。如圖6B所示，藏系綿羊瘤胃真菌可以鑒定為共生營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、病原營養(yǎng)型、病原-共生營養(yǎng)型、病原-腐生營養(yǎng)型、腐生-共生營養(yǎng)型、病原-腐生-共生營養(yǎng)型、病原-共生-腐生營養(yǎng)型、腐生-病原-共生營養(yǎng)型以及未分類的營養(yǎng)型，其中腐生營養(yǎng)型為藏系綿羊瘤胃真菌中最主要的營養(yǎng)型。

圖6 FUNGuid功能注釋分析Fig.6 Analysis of FUNGuid functional annotation

3 討論

蛋白質(zhì)是動物生長和發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。不同蛋白質(zhì)含量的飼糧在反芻動物瘤胃內(nèi)降解的產(chǎn)物濃度不同。當(dāng)飼糧中蛋白質(zhì)水平過低時，會導(dǎo)致反芻動物瘤胃中可降解蛋白質(zhì)含量降低，不能滿足微生物合成所需要的氮源，減少瘤胃微生物種群的數(shù)量，最終減緩動物生長速度，影響畜產(chǎn)品產(chǎn)出。反之，當(dāng)飼糧中蛋白質(zhì)水平過高，超出機(jī)體最大氮沉積量時，會引起家畜的代謝障礙和一系列相關(guān)代謝疾病，同時造成環(huán)境氮排放污染［13-14］。李海琴等［15］研究表明，當(dāng)飼糧中蛋白質(zhì)含量為14%時，小尾寒羊羔羊的平均日增重達(dá)到最大值，且瘤胃組織發(fā)育更好。吳玉江等［16］研究發(fā)現(xiàn)，西藏白絨山羊生長期飼糧中最適宜的蛋白質(zhì)含量為10.35%～11.29%。崔曉鵬等［17］研究發(fā)現(xiàn)，飼糧蛋白質(zhì)水平可以顯著影響藏系綿羊羔羊的生長發(fā)育，12%的蛋白質(zhì)水平可以更好地提高藏系綿羊羔羊的日增重，降低料重比，改善其血清生化指標(biāo)，本研究結(jié)果與此相似，即飼糧蛋白質(zhì)水平為12.10%和14.12%組的藏系綿羊活體重和日增重顯著高于10.06%組。另外，通過對大量研究結(jié)果匯總發(fā)現(xiàn)，不同品種羊的最適飼糧蛋白質(zhì)水平有所差別，這可能是由于其所處地理環(huán)境和生理構(gòu)造的不同，這也提示在相關(guān)營養(yǎng)學(xué)研究時要更加細(xì)致化。

反芻動物對飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用主要依賴瘤胃內(nèi)微生物的發(fā)酵吸收，瘤胃微生物多樣性及結(jié)構(gòu)組成在極大程度上又受到飼糧類型的影響［18］。研究表明，飼養(yǎng)方式、飼糧精粗比和飼糧營養(yǎng)水平等均可影響瘤胃中細(xì)菌多樣性和優(yōu)勢菌群的組成［19-21］，而對于瘤胃真菌的相關(guān)報(bào)道卻較少。本研究采用ITS高通量測序技術(shù)解析藏系綿羊瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)和功能，并探討飼糧蛋白質(zhì)水平對瘤胃菌群的影響。微生物研究中主要以Alpha多樣性指數(shù)來評估菌群多樣性，包括衡量物種豐富度的Chao1、ACE指數(shù)和衡量物種多樣性的Shannon、Simpson指數(shù)［22］。冶文興等［23］研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加果聚糖可以小幅改變中國荷斯坦奶牛瘤胃真菌ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，但對瘤胃真菌菌群整體的多樣性和豐富度均未產(chǎn)生顯著影響。付子琳等［24］結(jié)合OTU以及Alpha多樣性Chao1和ACE指數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，不同飼養(yǎng)模式下成年灘羊瘤胃真菌多樣性有所差別且放牧組灘羊瘤胃真菌豐富度顯著高于舍飼組。徐曉鋒等［25］研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧精粗比的增加，中國荷斯坦奶牛瘤胃真菌總數(shù)降低，多樣性升高。本試驗(yàn)中不同處理組間Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)有差別但均沒有達(dá)到顯著性水平，這表明改變飼糧中蛋白質(zhì)水平對藏系綿羊瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和豐富度有影響但不顯著。

在不同分類水平上對藏系綿羊瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析。在門分類水平上，藏系綿羊瘤胃真菌的優(yōu)勢菌門主要為子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉亞門和新美鞭菌門等，這也與牦牛、奶牛等其他反芻動物的瘤胃真菌組成相類似［23，26］。子囊菌門作為真菌界最大的一類微生物，在營養(yǎng)物質(zhì)消化過程中主要參與木質(zhì)素和角蛋白等有機(jī)物質(zhì)的降解［27］。新美鞭菌門是廣泛存在于山羊、綿羊、牛等食草動物消化道中的一種功能性真菌，在降解木質(zhì)化纖維素方面起重要作用［28］，還可以通過消耗瘤胃可降解蛋白為宿主提供生命活動所需營養(yǎng)成分［29］。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，在屬分類水平上藏系綿羊瘤胃液中豐度較高的真菌菌屬為青霉屬、無莖真菌屬、枝孢屬、鐮孢霉屬、鏈格孢屬等。張潔等［30］研究表明，灘羊瘤胃中的優(yōu)勢菌屬主要為梨霉屬、廣義釀酒酵母和裂褶菌屬等。冶文興等［23］研究表明，中國荷斯坦奶牛瘤胃真菌中豐度較高的為柄孢殼屬、曲霉屬和德巴利酵母屬等。王彩蝶等［31］研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克羊瘤胃液真菌屬水平相對豐度較高的為假絲酵母屬、假散囊菌屬和Metschnikow ia等。以上結(jié)果表明，不同物種在屬水平上相對豐度較高的優(yōu)勢菌差別較大。由于NCBI、KEGG和SwissProt等現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫缺少真菌的信息，所以導(dǎo)致真菌測序后仍存在大量未注釋到的基因［32］。

使用FUNGuid對藏系綿羊瘤胃真菌菌群進(jìn)行生態(tài)功能預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)，腐生營養(yǎng)型是藏系綿羊瘤胃真菌中最主要的營養(yǎng)類型。瘤胃菌群的生態(tài)功能與其結(jié)構(gòu)組成密切相關(guān)，藏系綿羊瘤胃在門水平上相對豐度最高的優(yōu)勢菌門為子囊菌門，子囊菌門多營腐生生活，用以分解瘤胃內(nèi)的有機(jī)物質(zhì)［33］。另外，由于大部分瘤胃真菌主要參與的是植物纖維的降解，真菌產(chǎn)生的多種消化酶主要附著于飼草料的表面，起到降解碳水化合物和纖維素的作用［24］。本研究只對藏系綿羊的瘤胃液真菌進(jìn)行了分析，未對瘤胃固態(tài)物進(jìn)行分析，可能會造成飼糧蛋白質(zhì)水平對真菌菌群影響不明顯的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，適當(dāng)提高飼糧中蛋白質(zhì)水平可以顯著提高藏系綿羊的生長性能，但飼糧蛋白質(zhì)水平并未對瘤胃真菌菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生明顯的影響。