王路逸，李澤軒，易 犁，馮 亮*

(1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430078；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

現(xiàn)代人對(duì)肉、蛋、奶等畜牧業(yè)產(chǎn)品的追求，使得畜牧業(yè)蓬勃發(fā)展，隨著生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，畜禽糞便的產(chǎn)量也在迅速增加，僅2016年我國(guó)畜牧業(yè)產(chǎn)生的糞便就達(dá)到3.16×109t，帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題[1]。畜禽糞便的傳統(tǒng)處理方式包括焚燒法、堆肥法、沼氣法和烘干膨化法等，這些處理方法雖然能在一定程度上利用糞便資源，但也會(huì)引起包括溫室效應(yīng)在內(nèi)的其他環(huán)境污染問(wèn)題[2-3]。畜禽糞便中通常含有大量的與畜禽各種病癥相關(guān)的病原菌，其中也不乏能引起人畜共患病的病原菌種類，如引起副傷寒的沙門氏菌等[4]。堆肥是能通過(guò)高溫有效殺滅畜禽糞便中各類有害病原菌的方法[5]，但在堆肥過(guò)程中如果處理不當(dāng)，糞堆容易對(duì)周邊的土壤環(huán)境、水環(huán)境造成污染，并對(duì)附近的人、動(dòng)物、植物健康產(chǎn)生威脅。近年來(lái)出現(xiàn)了多種生物治理糞便污染的方法來(lái)解決這一問(wèn)題，如黑水虻(HermetiaillucensL.)處理糞便技術(shù)則是其中的方法之一。

黑水虻，又名亮斑扁角水虻，原產(chǎn)于南美洲地區(qū)，雙翅目水虻科扁角水虻屬，是一類營(yíng)腐生的昆蟲(chóng)[6]。黑水虻的幼蟲(chóng)食量大、抗逆性強(qiáng)，能夠快速處理包括糞便在內(nèi)的有機(jī)廢棄物，同時(shí)能生產(chǎn)諸如畜禽飼料、生物柴油和抗菌活性物質(zhì)等多種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的附加產(chǎn)品，是一種頗具應(yīng)用前景的資源昆蟲(chóng)[7-10]。長(zhǎng)期的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黑水虻在處理畜禽糞便時(shí)能有效殺滅糞便中的各類病原菌，包括食品防疫過(guò)程中重點(diǎn)關(guān)注的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等[11-13]，但不同時(shí)期的試驗(yàn)結(jié)果并不完全一致，且對(duì)于同種病原菌如沙門氏菌等的殺滅規(guī)律也有存在矛盾的地方，這可能是試驗(yàn)條件的不同所致[14]。

黑水虻幼蟲(chóng)具有殺滅病原菌的能力通常被認(rèn)為來(lái)源于其作為昆蟲(chóng)所具有的高效免疫防御系統(tǒng)，這種免疫防御系統(tǒng)由抗菌肽、凝集素和溶菌酶等物質(zhì)與具有多種功能的血細(xì)胞共同構(gòu)建，同時(shí)昆蟲(chóng)腸道內(nèi)的微生物菌群也能對(duì)外源病原菌起到一定的抑制作用[15-17]。然而，在黑水虻殺滅病原菌的各種研究中，均只對(duì)黑水虻殺滅病原菌的規(guī)律做了詳細(xì)的闡述，缺乏對(duì)相關(guān)殺滅機(jī)制的探討，特別是具體到某種抑菌物質(zhì)。

為了解決以上問(wèn)題，本研究展開(kāi)了黑水虻幼蟲(chóng)處理病原菌的試驗(yàn)，喂養(yǎng)黑水虻幼蟲(chóng)的飼料包括兩種，分別為含病原菌菌液的無(wú)菌常規(guī)飼料和富含各類病原菌的雞糞飼料，用以探究黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)于某種病原菌殺滅的具體規(guī)律，并通過(guò)分離黑水虻幼蟲(chóng)的淋巴體液，對(duì)其中的抑菌物質(zhì)溶菌酶的活性進(jìn)行了檢測(cè)，嘗試解釋黑水虻幼蟲(chóng)殺菌的機(jī)制，為黑水虻處理糞便這一技術(shù)的發(fā)展提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料的制備

1.1.1 供試黑水虻幼蟲(chóng)的制備

黑水虻蟲(chóng)卵來(lái)自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心自行建立的水虻飼養(yǎng)平臺(tái)，將黑水虻蟲(chóng)卵置于28℃培養(yǎng)箱中孵化，于干凈飼料中培養(yǎng)至3日齡。

1.1.2 飼料的制備

黑水虻常規(guī)飼料主要成分是麩皮和玉米粉，將其以3∶2的比例混合，在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、30 min下反復(fù)滅菌3次，確保各類植物孢子被有效殺滅，保證無(wú)菌條件；雞糞飼料來(lái)自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)雞場(chǎng)，兩種飼料使用時(shí)保持含水量在70%左右。

1.1.3 供試病原菌的制備

本試驗(yàn)選用的病原菌分別是:①大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)，菌種編號(hào)ATCC43889；②沙門氏菌(Salmonella)，菌種編號(hào)ATCC14028;③金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，菌種編號(hào)ATCC43300。3種病原菌均來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室前期購(gòu)買保種，以甘油形式保存。

3種病原菌的活化均采用胰蛋白胨大豆肉湯和其相關(guān)的瓊脂培養(yǎng)基，配制方法為100 mL蒸餾水對(duì)應(yīng)添加1.7 g胰蛋白胨、0.3 g大豆蛋白胨、0.5 g氯化鈉、0.25 g磷酸氫二鉀、0.25 g葡萄糖，瓊脂培養(yǎng)基額外添加2 g瓊脂，混勻后調(diào)節(jié)pH值至7.3±0.2，于115℃下滅菌30 min后使用?；罨桨笧閷?種甘油菌分別涂布于胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基上劃線，并在37℃恒溫倒置培養(yǎng)16 h，隨后挑取單菌落接種于10 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，置于恒溫?fù)u床中37℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)16 h，得到活化菌液。

后續(xù)平板計(jì)數(shù)使用相對(duì)應(yīng)的選擇性顯色固體培養(yǎng)基，其中大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)使用的是伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，陽(yáng)性菌落呈帶有金屬光澤的黑色；沙門氏菌(ATCC14028)使用的是SS培養(yǎng)基，陽(yáng)性菌落帶有黑色中心；金黃色葡萄球菌(ATCC43300)使用的是甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，陽(yáng)性菌落呈黃色且?guī)в悬S色環(huán)。以上培養(yǎng)基均購(gòu)自于青島海博生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品為含瓊脂成分的粉末，按照產(chǎn)品說(shuō)明添加至錐形瓶中與對(duì)應(yīng)量蒸餾水混合，隨后置于高壓滅菌鍋中121℃、30 min滅菌，最后傾倒在一次性培養(yǎng)皿中制成固體培養(yǎng)基，備用。

1.2 病原菌飼養(yǎng)方法

1.2.1 病原菌飼料飼養(yǎng)法

該試驗(yàn)設(shè)計(jì)在一個(gè)封閉的室內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行，通過(guò)空調(diào)保證試驗(yàn)環(huán)境室內(nèi)溫度在(25±3)℃，以經(jīng)過(guò)滅菌處理的泡沫盒為飼養(yǎng)容器，泡沫盒密封但鉆有小孔以利于透氣。試驗(yàn)組分為3個(gè)小組，分別對(duì)應(yīng)添加大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)、沙門氏菌(ATCC14028)、金黃色葡萄球菌(ATCC43300)3種病原菌，每個(gè)試驗(yàn)組的對(duì)照組不添加黑水虻幼蟲(chóng)，其他條件類似，每個(gè)小組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)飼養(yǎng)18 d，每6 d作為一個(gè)試驗(yàn)周期。第0天向飼養(yǎng)箱中添加250 g已滅菌的常規(guī)飼料，再分別添加對(duì)應(yīng)的3 mL已過(guò)夜活化培養(yǎng)的病原菌菌液，攪拌均勻，取部分飼料樣品進(jìn)行病原菌平板計(jì)數(shù)，確定初始病原菌濃度，最后加入600只3日齡黑水虻幼蟲(chóng)進(jìn)行處理。之后試驗(yàn)組每2 d從飼養(yǎng)箱中取出若干只黑水虻幼蟲(chóng)和5 g蟲(chóng)沙(黑水虻幼蟲(chóng)糞便)，對(duì)照組則取飼養(yǎng)箱中的5 g飼料剩余物，作為蟲(chóng)沙的參照，供后續(xù)試驗(yàn)。第6天取樣之后，再往飼養(yǎng)盒中添加250 g含病原菌的飼料，保持每2 d取一次黑水虻幼蟲(chóng)以及蟲(chóng)沙樣品。第12天之后，打開(kāi)泡沫盒，不再取樣直到第18天收集全部蟲(chóng)沙樣品。本試驗(yàn)方法主要參考文獻(xiàn)[14]。

1.2.2 雞糞飼料飼養(yǎng)法

飼養(yǎng)環(huán)境同上述飼養(yǎng)方法，但以雞糞為飼料對(duì)黑水虻幼蟲(chóng)進(jìn)行飼養(yǎng)。試驗(yàn)組添加500 g雞糞和600只幼蟲(chóng)，對(duì)照組只加入雞糞，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)飼養(yǎng)14 d，第0天便加入全部量的雞糞與3日齡黑水虻幼蟲(chóng)，并保存部分初始雞糞樣品，之后試驗(yàn)組每2 d取5 g蟲(chóng)沙樣品。對(duì)照組每2 d取5 g雞糞，作為試驗(yàn)組蟲(chóng)沙的參照，以上雞糞和蟲(chóng)沙樣品均保存至-80℃冰箱中。

1.3 病原菌數(shù)量關(guān)系的測(cè)定方法

1.3.1 平板計(jì)數(shù)法

對(duì)于病原菌飼料飼養(yǎng)試驗(yàn)中病原菌存活數(shù)量的檢測(cè)采用平板計(jì)數(shù)法，即試驗(yàn)期間每次收集完病原菌飼料飼養(yǎng)試驗(yàn)得到的蟲(chóng)沙和飼料樣品之后，當(dāng)天就進(jìn)行梯度稀釋，再涂布于上述配制好的選擇性顯色固體培養(yǎng)基中，最后進(jìn)行計(jì)數(shù)。具體方案為：將得到的蟲(chóng)沙和飼料剩余物樣品按照1∶10(W/V)比例添加pH值為7.4的PBS緩沖液，經(jīng)振蕩混勻后，靜置10 min，取上清液；再使用PBS緩沖液進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋，取適宜稀釋度的100 μL溶液，涂布于對(duì)應(yīng)病原菌的選擇性顯色固體培養(yǎng)基上，于37℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)24 h，選擇顯陽(yáng)性顏色的菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品3個(gè)平行。該方法檢測(cè)的極限是100 CFU/g，如果提高涂布的溶液量至1 mL即可提高檢測(cè)極限到10 CFU/g。同時(shí)，對(duì)第6天和第12天取得的黑水虻幼蟲(chóng)進(jìn)行體內(nèi)病原菌檢測(cè)，同樣使用梯度稀釋和平板計(jì)數(shù)法，但需要進(jìn)行提前處理，具體操作為：先將黑水虻幼蟲(chóng)經(jīng)半天的饑餓處理，隨后用無(wú)菌水清洗表面，放入酒精中浸泡2 min，去除體表微生物，再用無(wú)菌水沖洗3次，擦干后放入2 mL滅菌離心管中；然后按照1∶10(W/V)的比例加入pH值為7.4的PBS緩沖液，倒入無(wú)菌碾缽中充分搗碎，經(jīng)高速離心機(jī)以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，得上清液后，進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板計(jì)數(shù)。

1.3.2 高通量病原菌芯片檢測(cè)法

由于雞糞微生物群落復(fù)雜，傳統(tǒng)的涂布平板計(jì)數(shù)法存在多種菌體干擾的問(wèn)題，而基于SmartChip Real-Time PCR System的高通量病原菌芯片檢測(cè)法則是通過(guò)檢測(cè)各種病原菌的毒力基因或者16S rRNA相關(guān)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)來(lái)作為病原菌總體存活數(shù)量的指標(biāo)，有效避免了病原菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)困難的問(wèn)題，因此對(duì)于雞糞喂食試驗(yàn)中病原菌存活數(shù)量的檢測(cè)則可以采用此方法。試驗(yàn)所用基因信息，見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所用基因信息

本檢測(cè)由廣東美格基因科技有限公司完成，具體檢測(cè)流程為：先將上述雞糞飼養(yǎng)試驗(yàn)中得到的蟲(chóng)沙、雞糞樣品送往公司進(jìn)行總DNA的提??；隨后利用相關(guān)芯片進(jìn)行熒光定量PCR，以確定各種反應(yīng)的CT值；最后代入根據(jù)混合質(zhì)粒做成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可推算出樣品中各種病原菌相關(guān)檢測(cè)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)。

1.4 溶菌酶活性的檢測(cè)

將上述病原菌飼料飼養(yǎng)試驗(yàn)得到的幼蟲(chóng)樣品進(jìn)行表面除菌處理，用采血針刺破尾部，收集淋巴體液[21]，將體液以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液得到粗酶液。后續(xù)溶菌酶活性檢測(cè)方法主要參考《溶菌酶活性檢測(cè)方法》(GB/T 30990—2014)，具體步驟為：將購(gòu)買于上海保藏生物技術(shù)中心的溶壁微球菌凍干粉按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行活化，制備成溶液；然后用0.1 mol/L pH值為6.4的PBS緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)溶液配成一定濃度的菌懸液，使其在分光光度計(jì)450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)光密度值約為0.7；最后取3 mL該菌懸液與100 μL粗酶液于試管中混勻，采用分光光度計(jì)于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值A(chǔ)0，并置于37℃水浴保溫30 min，取出后立刻置于冰浴中10 min以終止反應(yīng)，測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)處的光密度值A(chǔ)，即溶菌酶活性(U)=(A0-A)/A0。對(duì)照組為無(wú)菌飼料喂養(yǎng)的同條件黑水虻幼蟲(chóng)，每個(gè)樣品類型均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

本研究主要通過(guò)Microsoft Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和處理，并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)病原菌飼料中病原菌的殺滅效果

黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)病原菌飼料中大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)、沙門氏菌(ATCC14028)和金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的殺滅效果，見(jiàn)圖1。

圖1 黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)病原菌飼料中病原菌的殺滅效果

由圖1(a)可以看出：

(1) 試驗(yàn)組中，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)的第一次接種濃度為106.9～107.1CFU/g，在第2～4天濃度快速下降，第6天其濃度降低到檢測(cè)極限以下；在第6天大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)第二次接種后，其濃度達(dá)到105.6～105.8CFU/g，在第6～10天，相較第一次接種，其濃度下降的速度更快，并于第10天其濃度降低到檢測(cè)極限以下。

(2) 對(duì)照組中，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)的第一次接種濃度為 106.8～107.0CFU/g，在失去了黑水虻幼蟲(chóng)處理后，飼養(yǎng)箱中無(wú)菌的飼養(yǎng)環(huán)境給予了大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)適宜的繁殖條件，在第0～2天其濃度快速提高，但是在第2～4天其濃度開(kāi)始急速下降，第4～6天其濃度下降速度變緩；在第6天大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)第二次接種后其濃度仍呈下降趨勢(shì)，直至第18天依舊能檢測(cè)到大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)的存在。后續(xù)黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第6 天和第12天的黑水虻幼蟲(chóng)經(jīng)饑餓處理之后體內(nèi)均檢測(cè)不到大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)。

由圖1(b)可以看出：

(1) 試驗(yàn)組中，沙門氏菌(ATCC14028)的第一次接種濃度為105.8～106.1CFU/g，在第2～4天其濃度快速下降，第4天其濃度降低到檢測(cè)極限以下，在第6天沙門氏菌(ATCC14028)第二次接種后，其濃度達(dá)到105.7～105.9CFU/g，于第8天其濃度降低到檢測(cè)極限以下。

(2) 對(duì)照組中，沙門氏菌(ATCC14028)的第一次接種濃度為106.1～106.3CFU/g，與大腸桿菌O157∶H7對(duì)照組類似，在失去了黑水虻幼蟲(chóng)處理后，飼養(yǎng)箱中無(wú)菌的飼養(yǎng)環(huán)境使得沙門氏菌(ATCC14028)在第0～2天快速繁殖，其濃度迅速提高，而在第2～6天其濃度開(kāi)始下降；第二次接種沙門氏菌后，雖然沙門氏菌(ATCC14028)濃度呈一定的下降趨勢(shì)，但在第18天仍能在病原菌飼料中檢測(cè)到沙門氏菌的存在。后續(xù)黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第6天和12天的黑水虻幼蟲(chóng)經(jīng)饑餓處理之后體內(nèi)檢測(cè)不到沙門氏菌(ATCC14028)的存在。

由圖1(c)可以看出：

(1) 試驗(yàn)組中，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的第一次接種濃度為106.8～107.1CFU/g，在第2～6天其濃度下降，但未降低到檢測(cè)極限以下，在第6天仍能檢測(cè)到一定數(shù)量金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的存在，最后其濃度為101.0～101.2CFU/g；第二次接種金黃色葡萄球菌(ATCC43300)后，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)濃度達(dá)到106.7～106.9CFU/g，第6～12天其濃度呈下降趨勢(shì)，但經(jīng)過(guò)第2個(gè)處理周期，乃至第3個(gè)處理周期后，在第18天，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)仍未被殺滅至檢測(cè)極限以下，最后其濃度為101.6～102.0CFU/g。

(2) 對(duì)照組中，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的第一次接種濃度為106.5～106.8CFU/g，其濃度與大腸桿菌O157∶H7對(duì)照組和沙門氏菌對(duì)照組類似，呈先上升再下降的趨勢(shì)，均不能降低到檢測(cè)極限以下；在第二次接種到與試驗(yàn)組近似濃度后，后續(xù)能檢測(cè)到的濃度水平均低于試驗(yàn)組。后續(xù)黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第6天經(jīng)過(guò)涂平板發(fā)現(xiàn)黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)能夠檢測(cè)到金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的存在，而第12天的黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)則檢測(cè)不到金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的存在。

綜上所述，黑水虻幼蟲(chóng)能對(duì)病原菌飼料中攝取的3種病原菌產(chǎn)生一定的殺滅作用。在試驗(yàn)條件下，3日齡黑水虻幼蟲(chóng)在4～6 d的處理時(shí)間內(nèi)就能將大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)的濃度降低到檢測(cè)極限以下，可殺滅絕大部分的金黃色葡萄球菌(ATCC43300)；9日齡黑水虻幼蟲(chóng)在2～4 d的處理時(shí)間內(nèi)就能將大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)的濃度降低到檢測(cè)極限以下，可殺滅絕大部分金黃色葡萄球菌(ATCC43300)，但不能將金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的濃度降低到檢測(cè)極限以下。

2.2 黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)雞糞中病原菌的殺滅效果

黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)雞糞中病原菌的殺滅效果，見(jiàn)圖2。

圖2 黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)雞糞中病原菌的殺滅效果

由圖2(a)可知：試驗(yàn)組中，在第0～2天，eaeA基因的拷貝數(shù)下降幅度較大，達(dá)到了69.4%，在第2～8天，eaeA基因的拷貝數(shù)的下降趨勢(shì)變緩，直至第8天，eaeA基因的拷貝數(shù)才降低到檢測(cè)極限以下；對(duì)照組中，在第0～2天，eaeA基因拷貝數(shù)先呈下降趨勢(shì)，在第2～4天，eaeA基因的拷貝數(shù)呈一定的上升趨勢(shì)，之后第4～14天，eaeA基因的拷貝數(shù)才呈現(xiàn)穩(wěn)定下降的趨勢(shì)，直到試驗(yàn)結(jié)束的第14天，與初始雞糞中eaeA基因的拷貝數(shù)相比，其總體下降了79.3%。

由圖2(b)可知：試驗(yàn)組中，在第0～8天，invA基因的拷貝數(shù)的下降趨勢(shì)相比eaeA基因要較為平緩，但同樣在第8天，invA基因的拷貝數(shù)降到檢測(cè)極限以下；對(duì)照組中，invA基因的拷貝數(shù)也呈現(xiàn)一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的下降趨勢(shì)，在第14天，與初始雞糞中invA基因的拷貝數(shù)相比，其下降了73.8%。

由圖2(c)可知：試驗(yàn)組中，在第0～4天，sec基因的拷貝數(shù)呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，但4 d的處理時(shí)間，sec基因的拷貝數(shù)只下降了42.6%，而在第4～6天，sec基因的拷貝數(shù)又出現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后在第6～12天，sec基因的拷貝數(shù)才呈現(xiàn)穩(wěn)定的下降趨勢(shì)，直至第12天，sec基因的拷貝數(shù)降低到檢測(cè)極限以下；對(duì)照組中，在第0～8天，sec基因的拷貝數(shù)總體呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)，第8～14天，sec基因的拷貝數(shù)則呈現(xiàn)一個(gè)下降的趨勢(shì)，在第14天，與初始雞糞中sec基因的拷貝數(shù)相比，其下降了48.9%。

綜上所述，在試驗(yàn)條件下處理雞糞時(shí)，黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)從雞糞中攝取的3種病原菌具有一定的殺滅作用，8 d的處理時(shí)間內(nèi)能將大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)基因的拷貝數(shù)降低到檢測(cè)極限以下，12 d的處理時(shí)間內(nèi)能將金黃色葡萄球菌(ATCC43300)基因的拷貝數(shù)降低到檢測(cè)極限以下；而不經(jīng)黑水虻幼蟲(chóng)處理的自然條件下，各病原菌基因的拷貝數(shù)也會(huì)降低，但均不能降低到檢測(cè)極限以下。

2.3 黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶活性的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)病原菌飼料喂養(yǎng)之后，各試驗(yàn)組與對(duì)照組黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)的溶菌酶活性變化，見(jiàn)圖3。

圖3 黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)的溶菌酶活性變化

由圖3可知：經(jīng)病原菌飼料喂養(yǎng)之后，各試驗(yàn)組黑水虻幼蟲(chóng)淋巴體液中溶菌酶活性在前4 d會(huì)有較大的提高，其中金黃色葡萄球菌(ATCC43300)試驗(yàn)組溶菌酶活性的提高效果最為明顯，沙門氏菌(ATCC14028)試驗(yàn)組其次，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)試驗(yàn)組隨后，但對(duì)照組溶菌酶活性提升不明顯；第6天各試驗(yàn)組黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶活性比第4天低，根據(jù)前述病原菌飼料的試驗(yàn)結(jié)果，此時(shí)大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)試驗(yàn)組和沙門氏菌(ATCC14028)組中病原菌已經(jīng)降低到檢測(cè)極限以下，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)組中病原菌數(shù)量也下降到了較低的水平；第2次添加病原菌飼料之后，環(huán)境中的病原菌數(shù)量增加，第8天各試驗(yàn)組黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶活性對(duì)比第6天均有提高，到達(dá)峰值且溶菌酶活性要高于第4天,第10天由于大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)試驗(yàn)組和沙門氏菌(ATCC14028)試驗(yàn)組中病原菌數(shù)量降低到檢測(cè)極限以下，各試驗(yàn)組黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶活性均有降低，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)試驗(yàn)組和沙門氏菌(ATCC14028)試驗(yàn)組達(dá)到對(duì)照組相似的水平，金黃色葡萄(ATCC43300)球菌組仍高于對(duì)照組，第12天各試驗(yàn)組和對(duì)照組黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶活性與第10天相比沒(méi)有顯著性差別(p>0.05)。

根據(jù)以上結(jié)果可知，黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶的活性變化與環(huán)境內(nèi)的病原菌數(shù)量相關(guān)，病原菌數(shù)量增加時(shí)，黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶的活性也隨之提高，病原菌數(shù)量降低時(shí)，黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶活性也會(huì)降低。因此，將第0天的各組病原菌數(shù)量對(duì)應(yīng)第2天的各組溶菌酶活性，以此類推，利用CORREL函數(shù)計(jì)算出病原菌數(shù)量與黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)溶菌酶活性的相關(guān)系數(shù)r，見(jiàn)表2。

表2 病原菌數(shù)量與溶菌酶活性的相關(guān)系數(shù)

由表2可知，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)組和沙門氏菌(ATCC14028)組的病原菌數(shù)量與溶菌酶活性存在中度正相關(guān)關(guān)系(0.50.8)。

3 討 論

在人為富集單一病原菌并制成病原菌飼料喂食給3日齡黑水虻幼蟲(chóng)的試驗(yàn)條件下，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)濃度在4～6 d的處理時(shí)間內(nèi)會(huì)降到平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)極限以下(10 CFU/g)，這個(gè)檢測(cè)極限較低，幾乎可以認(rèn)為大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)被完全清除，而金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的存活數(shù)量高于檢測(cè)極限，沒(méi)有被完全清除，導(dǎo)致這種差異的可能原因是金黃色葡萄球菌(ATCC43300)為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)，其抗逆性比大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)這兩種革蘭氏陰性菌(G-)強(qiáng)，黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)其的殺滅能力有限，同時(shí)這也可能與昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)G+和G-的免疫途徑不同有關(guān)[22]。第二次添加病原菌飼料之后，病原菌接種的濃度與第一次接種處于相似水平，大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)被完全清除所需要的時(shí)間均減少了2 d，此時(shí)試驗(yàn)環(huán)境沒(méi)有較大的改變，主要變量在于黑水虻幼蟲(chóng)的日齡，這說(shuō)明日齡較大的黑水虻幼蟲(chóng)殺滅病原菌的能力更強(qiáng)，而溶菌酶活性檢測(cè)試驗(yàn)中日齡大的黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)的溶菌酶活性峰值要大于日齡小的黑水虻幼蟲(chóng)，這與上述現(xiàn)象相符合。

在雞糞喂食黑水虻幼蟲(chóng)試驗(yàn)中，雞糞中的病原菌數(shù)量變化與病原菌飼料試驗(yàn)的結(jié)果類似，試驗(yàn)組在有黑水虻幼蟲(chóng)處理的情況下，作為數(shù)量指標(biāo)的基因拷貝數(shù)對(duì)比對(duì)照組下降速度更快，不同的是，在病原菌飼料喂食試驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)作為革蘭氏陽(yáng)性菌在整個(gè)18 d的試驗(yàn)周期內(nèi)，并不能被完全清除，而在雞糞喂食試驗(yàn)中，其相關(guān)的sec基因拷貝數(shù)在第12天就降低到芯片能檢測(cè)到的極限以下。由于兩組喂食試驗(yàn)的環(huán)境條件相似，以上現(xiàn)象可能是兩個(gè)喂食試驗(yàn)存在的差異所致，即檢測(cè)技術(shù)和飼料基質(zhì)的不同。檢測(cè)技術(shù)方面，平板計(jì)數(shù)法要求樣品中的病原菌必須處于可培養(yǎng)的存活狀態(tài)，病原菌生長(zhǎng)狀態(tài)受到培養(yǎng)條件的影響較大，因此單菌落的計(jì)數(shù)結(jié)果不能反映病原菌存活的準(zhǔn)確數(shù)量，但僅比較各個(gè)樣品間病原菌數(shù)量的多少，以及判斷病原菌是否被完全清除這兩個(gè)方面則相對(duì)可靠。高通量病原菌芯片檢測(cè)法以qPCR為基本技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)能夠從側(cè)面反映病原菌的存活數(shù)量，但此方法也存在一定的缺陷，即病原菌被殺滅后，其包含的相關(guān)基因不會(huì)立刻降解而是存在延時(shí)性，這會(huì)對(duì)病原菌存活的計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾，而暴露在腸道環(huán)境下的DNA容易變性或者被水解吸收，不能長(zhǎng)時(shí)間保持完整性，所以該干擾對(duì)各種病原菌被完全清除所用時(shí)間的結(jié)果影響較小。由于將一部分死菌也計(jì)入數(shù)量指標(biāo)，高通量病原菌芯片檢測(cè)法在說(shuō)明病原菌是否被完全清除方面比平板計(jì)數(shù)法更為靈敏。在雞糞喂食黑水虻幼蟲(chóng)試驗(yàn)中使用更為靈敏的檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)被完全清除，說(shuō)明以上現(xiàn)象不是檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生的誤差所致，更可能是飼養(yǎng)基質(zhì)的不同導(dǎo)致的差別。兩種飼料基質(zhì)最大的區(qū)別在于其中的微生物群落多樣性，雞糞中的微生物群落組成遠(yuǎn)比含單一菌液的飼料復(fù)雜，其中優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng)會(huì)對(duì)非優(yōu)勢(shì)菌群的數(shù)量產(chǎn)生影響，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)可能并非雞糞中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，其本身的繁殖生長(zhǎng)到某個(gè)階段會(huì)受到其他微生物的抑制，在黑水虻幼蟲(chóng)協(xié)同處理后便會(huì)被完全清除。

檢測(cè)黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)病原菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑水虻幼蟲(chóng)在停止攝取病原菌并進(jìn)行饑餓處理后，腸道內(nèi)部檢測(cè)不到大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)，第6天的黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)能檢測(cè)到金黃色葡萄球菌(ATCC43300)，而第12天的黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)不到金黃色葡萄球菌(ATCC43300)，其原因可能是金黃色葡萄球菌(ATCC43300)的抗逆能力強(qiáng)，能在黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)存在較長(zhǎng)時(shí)間，而當(dāng)黑水虻幼蟲(chóng)生長(zhǎng)之后殺菌能力提升，金黃色葡萄球菌(ATCC43300)在體內(nèi)就會(huì)被完全清除，這說(shuō)明黑水虻幼蟲(chóng)在具有殺菌能力的同時(shí)，自身不會(huì)被這3種病原菌所感染，是一種較為安全的昆蟲(chóng)資源。

黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)的溶菌酶活性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶菌酶的活性是伴隨著病原菌數(shù)量的變化而變化的，病原菌數(shù)量處于較高水平時(shí)，溶菌酶活性會(huì)增加，病原菌數(shù)量處于低水平乃至被完全清除時(shí)，試驗(yàn)組溶菌酶活性會(huì)降到?jīng)]有病原菌脅迫的對(duì)照組水平，通過(guò)病原菌數(shù)量與溶菌酶活性的相關(guān)系數(shù)也能發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，而溶菌酶本身作為一種廣譜的抑菌活性物質(zhì)，其能通過(guò)催化細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的水解達(dá)到殺滅細(xì)菌的效果[23]，因此可以推測(cè)溶菌酶參與了黑水虻幼蟲(chóng)殺滅病原菌的過(guò)程，但需要后續(xù)的提純和體外試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

除去上述提到的雞糞中的微生物群落和溶菌酶參與了黑水虻殺滅病原菌的機(jī)制，黑水虻腸道內(nèi)的微生物菌群同樣可能參與了殺滅病原菌的機(jī)制。如江承亮[24]的研究發(fā)現(xiàn)，黑水虻幼蟲(chóng)處理含各種細(xì)菌的餐廚垃圾堆體時(shí)，其腸道內(nèi)的部分菌群會(huì)定殖于堆體之中，這種堆體雖然有著更強(qiáng)的外界抵抗力，但是堆體的細(xì)菌群落多樣性會(huì)降低，推測(cè)是黑水虻幼蟲(chóng)腸道內(nèi)的微生物入侵所致，同時(shí)黑水虻幼蟲(chóng)腸道中的菌體群落也會(huì)受到堆體中菌群的影響。本研究雖然采用了與上述研究不同的飼料基質(zhì)，但是飼料中病原菌被完全清除造成飼養(yǎng)環(huán)境中微生物群落多樣性降低這一現(xiàn)象與上述研究相符，因而可能具有相同的滅菌機(jī)制。

4 結(jié) 論

(1) 通過(guò)兩種喂養(yǎng)黑水虻幼蟲(chóng)的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑水虻幼蟲(chóng)對(duì)于大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)、沙門氏菌(ATCC14028)、金黃色葡萄球菌(ATCC43300)均具有一定的殺滅能力。在單一病原菌飼料飼養(yǎng)條件下，3日齡黑水虻幼蟲(chóng)在4～6 d的處理時(shí)間內(nèi)就能將大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)完全清除，并將金黃色葡萄球菌(ATCC43300)濃度降低到非常低的水平，抑制率在 99%以上，9日齡黑水虻幼蟲(chóng)則僅需要2～4 d的處理時(shí)間就能達(dá)到類似的殺菌效果，說(shuō)明日齡大的黑水虻幼蟲(chóng)殺菌能力更強(qiáng)；在雞糞飼養(yǎng)條件下，黑水虻幼蟲(chóng)在8 d的處理時(shí)間內(nèi)就能完全清除大腸桿菌O157∶H7(ATCC43889)和沙門氏菌(ATCC14028)，12 d的處理時(shí)間內(nèi)能完全清除金黃色葡萄球菌(ATCC43300)。

(2) 黑水虻幼蟲(chóng)攝取病原菌一段時(shí)間后停止進(jìn)食，腸道內(nèi)的3種病原菌會(huì)被逐漸殺滅，自身不會(huì)受到病原菌的感染。

(3) 黑水虻幼蟲(chóng)體內(nèi)的溶菌酶活性與病原菌數(shù)量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，根據(jù)溶菌酶自身的功能，推測(cè)溶菌酶參與了黑水虻幼蟲(chóng)殺滅病原菌的過(guò)程。