曹磊 張成立 侯穎

肺癌是起源于肺部支氣管黏膜、腺體的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率及死亡率[1]。肺癌細(xì)胞的異常增殖及侵襲活動(dòng)對(duì)肺癌的發(fā)展具有促進(jìn)作用。微小RNA(microRNA，miR)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，其失調(diào)與肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲活動(dòng)密切相關(guān)[2]。有研究表明，miR-367-3p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[3]。細(xì)胞周期素D2重組蛋白(recombinant cyclin D2 protein，CCND2)是D型細(xì)胞周期蛋白cyclin蛋白家族成員，與肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移活動(dòng)聯(lián)系密切[4-5]，抑制CCND2表達(dá)可降低非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[5]。靶基因預(yù)測(cè)顯示,miR-367-3p與CCND2存在結(jié)合位點(diǎn)。本研究探究miR-367-3p調(diào)控CCND2表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響。

材料與方法

一、材料

人肺癌細(xì)胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細(xì)胞HLF-a于武漢普諾賽生命科技有限公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將人肺癌細(xì)胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細(xì)胞HLF-a接種到RPMI1640培養(yǎng)基(含10%FBS)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次新鮮培養(yǎng)基。

2.肺癌細(xì)胞中miR-367-3p表達(dá)水平的測(cè)定：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺癌細(xì)胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細(xì)胞HLF-a，提取細(xì)胞總DNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6作為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。miR-367-3p引物序列5'-3'：上游AGTGCAGGGTCCGAGGTATT，下游CGACGAATTGCACTTTAGC；U6引物序列5'-3'：上游CGAGCACAGAATCGCTTCA，下游CTCGCTTCGGCAGCACATAT。根據(jù)2-△△CT算法分析miR-367-3p相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：收集人肺癌細(xì)胞Calu，分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、miR-367-3p NC組(轉(zhuǎn)染miR-367-3p陰性對(duì)照)、miR-367-3p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-367-3p模擬物)、miR-367-3p mimic+pc-CCND2組(共轉(zhuǎn)染miR-367-3p模擬物和pc-CCND2)。使用EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染試劑對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染。

4.肺癌細(xì)胞Calu的細(xì)胞活力測(cè)定：將Calu細(xì)胞按照1 500個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 小時(shí)后加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值，按照公式計(jì)算各組Calu細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(A測(cè)定-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

5.肺癌細(xì)胞Calu凋亡情況測(cè)定：調(diào)整Calu細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，取100 μl置于流式管中，依次加入5 μl AnnexinV/Alexa Fluor、10 μl碘化丙啶(PI，20 μg/ml)溶液，混勻、避光室溫孵育15 分鐘后加入400 μl的PBS緩沖液，于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)Calu細(xì)胞凋亡情況。

6.肺癌細(xì)胞Calu侵襲、遷移能力測(cè)定：調(diào)整Calu細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，在24孔板中放入鋪設(shè)好Matrigel膠的Transwell小室，取200 μl各組Calu細(xì)胞懸液添加至上室，取適量含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液于下室，培養(yǎng)24 小時(shí)，PBS緩沖液沖去上室殘留細(xì)胞后用多聚甲醛固定(20 分鐘)，結(jié)晶紫染色、干燥，顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。將Calu細(xì)胞接種于6孔板并培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)到90%，用槍頭在6孔板底部作劃痕，培養(yǎng)24小時(shí)，顯微鏡下觀察并分析細(xì)胞遷移能力，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0小時(shí)劃痕寬度-24小時(shí)劃痕寬度)/0小時(shí)劃痕寬度×100%。

7.肺癌細(xì)胞Calu中CCND2、凋亡、侵襲相關(guān)蛋白測(cè)定：用高效RIPA裂解液提取Calu細(xì)胞中總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉(1 小時(shí))后，加入兔源CCDN2、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗，低溫孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 小時(shí)，顯色、曝光、凝膠成像儀觀察并分析條帶。

8.miR-367-3p與CCND2靶向關(guān)系驗(yàn)證：Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)查詢miR-367-3p和CCDN2結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建突變型(CCDN2-MUT)、野生型(CCDN2-WT)熒光素酶表達(dá)載體，將CCDN2-MUT、CCDN2-WT分別與miR-367-3p mimic NC、miR-367-3p mimic共轉(zhuǎn)染至Calu細(xì)胞中，培養(yǎng)24 小時(shí)后測(cè)定各組Calu細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.各細(xì)胞中miR-367-3p表達(dá)水平比較：與人正常肺細(xì)胞HLF-a相比，人肺癌細(xì)胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647中miR-367-3p表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，Calu細(xì)胞中miR-367-3p表達(dá)相對(duì)較低(表1)，因此選取Calu細(xì)胞用于后續(xù)研究。

表1 各細(xì)胞中miR-367-3p表達(dá)水平比較

2.各組肺癌細(xì)胞Calu中miR-367-3p、CCND2表達(dá)水平比較：與對(duì)照組比較，miR-367-3p NC組miR-367-3p、CCND2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細(xì)胞中miR-367-3p表達(dá)顯著升高，CCND2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組相比，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細(xì)胞中CCND2蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組Calu細(xì)胞中miR-367-3p及CCND2表達(dá)水平比較

3.各組肺癌細(xì)胞Calu細(xì)胞活力比較：與對(duì)照組比較，miR-367-3p NC組Calu細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細(xì)胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+ pc-CCND2組Calu細(xì)胞活力顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組Calu細(xì)胞的細(xì)胞活力比較

4.各組肺癌細(xì)胞Calu凋亡情況比較：與對(duì)照組比較，miR-367-3p NC組Calu細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組Calu細(xì)胞凋亡情況比較

5.各組肺癌細(xì)胞Calu侵襲、遷移情況比較：與對(duì)照組相比，miR-367-3p NC組侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細(xì)胞侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細(xì)胞侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組Calu細(xì)胞侵襲、遷移情況比較

6.miR-367-3p與CCND2靶向關(guān)系測(cè)定：TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，miR-367-3p在CCND2的3'-UTR區(qū)存在相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)(圖1)；熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，與CCND2 WT+miR-367-3p NC組(1.00±0.08)相比，CCND2 WT+miR-367-3p mimic組Calu細(xì)胞熒光素酶活性(0.43±0.07)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CCND2 MUT+miR-367-3p NC組(0.99±0.10)及CCND2 MUT+miR-367-3p mimic組(1.01±0.13)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 miR-367-3p和CCND2的3'-UTR區(qū)序列相互結(jié)合

討論

目前，肺癌常用的治療手段有手術(shù)切除、放化療、分子靶向治療、藥物治療等。肺癌的治療已取得較大進(jìn)展，但由于肺癌就診時(shí)多為晚期，大多數(shù)病人的生存質(zhì)量及預(yù)后仍不理想[6-7]。miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的參與肺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，主要通過(guò)與靶基因的3'-UTR區(qū)配對(duì)來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的促癌、抑癌作用[2]。miR-367-3p是miRNA302-367家族成員，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miR-367-3p與肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移活動(dòng)聯(lián)系密切[8]，萬(wàn)亮[3]研究發(fā)現(xiàn)，miR-367-3p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)低于正常肺上皮細(xì)胞，Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，提高miR-367-3p的表達(dá)可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，人肺癌細(xì)胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647中miR-367-3p表達(dá)水平顯著低于人正常肺細(xì)胞HLF-a，其中Calu細(xì)胞中miR-367-3p表達(dá)相對(duì)較低，因此選取Calu細(xì)胞用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-367-3p NC組與對(duì)照組相比miR-367-3p及CCND2蛋白表達(dá)大致相同，miR-367-3p mimic組miR-367-3p表達(dá)顯著高于對(duì)照組，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細(xì)胞中CCND2蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，提示實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果較好。

惡性增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤導(dǎo)致病人分期較高、預(yù)后較差、死亡率高的主要原因，腫瘤的惡性程度越大，細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，鄰近的正常組織越易被侵犯，最終導(dǎo)致腫瘤面積擴(kuò)大[10]。因此，探究miR-367-3p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響具有重要意義。Caspase-3、Bax為重要的促凋亡因子，Bax主要通過(guò)增強(qiáng)Caspase-3水平發(fā)揮作用，Bcl-2是重要的抗凋亡因子，具有阻止細(xì)胞凋亡的作用，測(cè)定細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平可間接反映細(xì)胞的凋亡能力[11]。MMP-2、MMP-9與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移活動(dòng)聯(lián)系密切，是MMPs家族成員，測(cè)定細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平可反映細(xì)胞的侵襲、遷移能力[12]。本研究結(jié)果顯示，提高miR-367-3p表達(dá)，可顯著降低Calu細(xì)胞的細(xì)胞活力及侵襲、遷移能力，降低細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平，提示miR-367-3p高表達(dá)可顯著降低肺癌細(xì)胞Calu的增殖及遷移能力，并促進(jìn)其凋亡，但其機(jī)制仍不清晰。

CCND2是D型細(xì)胞周期蛋白cyclin蛋白家族成員，與肺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移活動(dòng)聯(lián)系密切。Jin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)CCND2表達(dá)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展。多項(xiàng)研究表明，miRNA可靶向調(diào)節(jié)CCND2參與非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程。Yao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-671-3p可靶向抑制CCND2抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展。He等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4317可靶向抑制CCND2抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移及侵襲，提高CCND2表達(dá)后可減弱miR-4317的抑制作用。Targetscan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-367-3p與CCND2的3'-UTR區(qū)存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-367-3p過(guò)表達(dá)能顯著下調(diào)野生型CCND2-3'UTR熒光素酶活性，表明miR-367-3p可直接靶向調(diào)節(jié)CCND2的表達(dá)，并且，CCND2過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-367-3p過(guò)表達(dá)對(duì)Calu細(xì)胞活力、侵襲、遷移能力的抑制作用。提示miR-367-3p抑制肺癌細(xì)胞Calu的增殖、遷移能力可能是通過(guò)抑制CCND2表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-367-3p過(guò)表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞Calu的增殖、遷移能力，可能是通過(guò)靶向抑制CCND2實(shí)現(xiàn)的。本研究存在不足之處，由于條件及時(shí)間限制，未做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果。