張 雷，張 瑩，賴恩銘，陳文洋，周 林，李 婧

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

基因治療是通過遞送外源正?；蜻M入靶細(xì)胞，改變?nèi)毕莼蛐蛄羞_到治療目的的醫(yī)用方法[1-2]，其關(guān)鍵在于選擇合適的遞送載體。非病毒載體由于具有制備簡單、低免疫原性、低毒性和可生物降解等優(yōu)點，成為研究較為廣泛的遞送載體[3-4]。非病毒載體納米級別的粒徑有助于實現(xiàn)載體的靶向性和有效性。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物顆粒的粒徑達到一定尺寸時，能夠通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞，并且真核細(xì)胞中網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用具有顯著的顆粒尺寸依賴性。顆粒表面Zeta電位也是影響內(nèi)吞作用的一個因素，Zeta電位為正的顆粒容易吸附在細(xì)胞膜表面，進而促進內(nèi)吞作用。

目前，研究的非病毒載體主要包括陽離子多聚物、納米顆粒及陽離子脂質(zhì)體等[3,7]。其中，陽離子脂質(zhì)體的正電荷頭部能夠與質(zhì)粒DNA上的負(fù)電性磷酸根靜電吸引，疏水脂肪鏈尾部能將質(zhì)粒DNA縮聚為球狀粒子，這些特點引起了許多研究者的興趣[8-11]。作者所在課題組前期合成了一類烷基锍類化合物[12](圖1a)，由于該類化合物含有锍正離子和疏水脂肪鏈，從而具備了復(fù)合質(zhì)粒DNA的能力?；衔铫窈廷蚝蠧12烷基鏈，在硫磷比(S/P)為40/1、50/1時顯示出弱阻滯效果；化合物Ⅲ、Ⅳ含有C16烷基鏈，在S/P 為30/1時顯示出弱阻滯效果，在S/P 為40/1、50/1時顯示出較好的阻滯效果(圖1b)。

圖1 烷基锍類化合物的結(jié)構(gòu)式(a)及烷基锍類化合物與gWiz-GFP質(zhì)粒復(fù)合后的凝膠阻滯電泳圖譜(b)Fig.1 Structural formula of alkyl-sulfonium compound(a) and electrophoretic mobility shift assay spectra(b) of alkyl-sulfonium compound and plasmid gWiz-GFP condensates

為深入研究烷基锍類化合物作為基因載體的性能，作者通過動態(tài)光散射實驗測定化合物Ⅰ～Ⅳ與質(zhì)粒DNA復(fù)合物的粒徑和Zeta電位，通過MTT法研究化合物Ⅰ～Ⅳ的細(xì)胞毒性，通過熒光顯微鏡觀察復(fù)合物的細(xì)胞攝取情況，為烷基锍類化合物基因載體的設(shè)計與轉(zhuǎn)染能力提升提供基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

人肝癌細(xì)胞株 Hep3B、HepG2、Huh7，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，本實驗室長期凍存?zhèn)鞔囵B(yǎng)。

烷基锍類化合物Ⅰ～Ⅳ，自制。乙腈、二甲基亞砜(DMSO)，分析純，泉瑞試劑公司；蛋白胨、酵母粉、氯化鈉，Oxoid 公司；卡那霉素，Biosharp公司；DH-5α，TIANGEN 公司；gWiz-GFP質(zhì)粒，Aldevron 公司；EndoFree Plasmid Mega Kit，Qiagen公司；噻唑藍(lán)(MTT)胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液(100×)，Solarbio公司；DMEM/F12 高糖培養(yǎng)基，Thermo Fisher 公司；聚乙烯亞胺(PEI，25 kDa)，Sigma公司；胎牛血清，四季青公司；Label IT Cy5標(biāo)記試劑盒，Mirus Bio公司。

Nano-ZS ZEN型激光粒度儀，Malvern公司；Thermo Nanodrop 2000C 型分光光度計，Thermo Scientific公司；ELX800型全自動酶標(biāo)儀，BioTek Instruments 公司；Leica DMI 4000B型顯微鏡。

1.2 溶液的配制

gWiz-GFP質(zhì)粒DNA通過大腸桿菌進行擴增并提取[12]。

用乙腈將化合物Ⅰ～Ⅳ配制成30 nmol·μL-1的溶液，將gWiz-GFP質(zhì)粒配制成25 ng·μL-1的溶液，用于復(fù)合物粒徑、Zeta 電位的測定。

用DMSO將化合物Ⅲ、Ⅳ和PEI倍數(shù)稀釋成31.25 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、1.25 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1等5個濃度，用于MTT法細(xì)胞毒性檢測。

用DMSO將化合物Ⅲ、Ⅳ配制成10 nmol·μL-1的溶液，將PEI配制成6 nmol·μL-1的溶液。將gWiz-GFP質(zhì)粒配制成100 ng·μL-1的溶液后，使用試劑盒進行Cy5標(biāo)記。用于復(fù)合物細(xì)胞攝取能力檢測。

1.3 復(fù)合物粒徑、Zeta 電位的測定

分別取化合物溶液(3.3 μL、4.1 μL )與雙蒸水(28.7 μL、27.9 μL)混合成32 μL體系溶液；分別加入gWiz-GFP質(zhì)粒32 μL(800 ng)，漩渦振蕩 10 s 后，室溫靜置20 min，形成S/P為40/1、50/1的化合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物，將復(fù)合物用雙蒸水稀釋至1 mL，采用激光粒度儀測定其粒徑、Zeta 電位。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞傳代：人肝癌細(xì)胞株 Hep3B、HepG2、Huh7分別用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(10%FBS培養(yǎng)液)培養(yǎng)，待10 cm培養(yǎng)皿長滿90%細(xì)胞后，吸棄培養(yǎng)液，用8 mL PBS緩沖液清洗細(xì)胞，吸棄PBS緩沖液，用1 mL胰蛋白酶消化細(xì)胞1 min，加入9 mL 10%FBS培養(yǎng)液阻斷消化，用移液槍將貼壁細(xì)胞吹下，1 000 r·min-1離心3 min；吸棄上清，加入10 mL 10%FBS培養(yǎng)液，移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，按1∶3的比例傳代。

細(xì)胞培養(yǎng)：取第三代對數(shù)生長期的細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)法計數(shù)。取適量細(xì)胞，以每孔200 μL 10%FBS培養(yǎng)液接種于96孔板中；置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h以上直至細(xì)胞貼壁；隨后將細(xì)胞培養(yǎng)液置換成200 μL 1%FBS血清培養(yǎng)液或無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)至觀測時間。

1.5 MTT法細(xì)胞毒性檢測

于96孔板中，接種200 μL密度為每孔8 000個的細(xì)胞，培養(yǎng)8 h至貼壁；取配制好的不同濃度化合物Ⅲ、Ⅳ和PEI溶液加入到96孔板中，每孔加樣量為1 μL(空白孔加入DMSO)，最終上樣濃度(μg·mL-1)分別為0、0.01、0.25、1.25、6.25、31.25；將處理好的96孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入90 μL不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入10 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，每孔(包括空白孔)加入150 μL DMSO，水平搖床振蕩10～20 min，用酶標(biāo)儀測定490 nm處每孔的吸光度，計算細(xì)胞存活率。

1.6 復(fù)合物細(xì)胞攝取能力檢測

將細(xì)胞爬片置于24孔板中，接種500 μL密度為每孔40 000個的細(xì)胞，培養(yǎng)8 h至貼壁。取化合物溶液9.8 μL與DMEM/F12高糖培養(yǎng)基40.2 μL混合成50 μL溶液。取參照PEI溶液4 μL與DMEM/F12高糖培養(yǎng)基46 μL混合成50 μL溶液。取Cy5標(biāo)記的質(zhì)粒DNA (8 μL，100 ng·μL-1)與DMEM/F12高糖培養(yǎng)基42 μL混合成50 μL溶液，以質(zhì)粒DNA輕輕加入化合物的方式制備成100 μL的復(fù)合物溶液。避光靜置30 min后，加入到24孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，并用PBS緩沖液洗滌3次，每次8 min；加入4%多聚甲醛溶液靜置30 min，進行細(xì)胞固定，用PBS緩沖液洗滌3次，每次10 min；加入1%曲拉通溶液靜置20 min，進行細(xì)胞膜打孔，用PBS緩沖液洗滌3次，每次15 min；用含DAPI的封片劑將細(xì)胞爬片固定在載玻片上，進行細(xì)胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察熒光分布情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合物的粒徑和Zeta電位(圖2)

圖2 復(fù)合物的粒徑(a)和Zeta電位(b)Fig.2 Particle size(a) and Zeta potential(b) of condensates

烷基锍類化合物的正電荷頭部與質(zhì)粒DNA中電負(fù)性磷酸根靜電吸引，疏水脂肪鏈尾部能將質(zhì)粒DNA縮聚成納米顆粒，適合尺寸的納米顆粒會通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞，Zeta電位為正的顆粒更容易吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，加快內(nèi)吞作用。由圖2a可知，4個化合物與質(zhì)粒DNA在S/P為40/1、50/1形成的復(fù)合物，粒徑均在160～210 nm之間。由圖2b可知，烷基鏈的長度明顯影響復(fù)合物的Zeta電位，烷基鏈越長對質(zhì)粒DNA的復(fù)合能力越強?；衔铫?、Ⅱ與質(zhì)粒DNA在S/P比為40/1和50/1形成的復(fù)合物，Zeta電位均為負(fù)值；化合物Ⅲ、Ⅳ與質(zhì)粒DNA在S/P為40/1和50/1形成的復(fù)合物，Zeta電位均在+20 mV左右。另外，噻吩環(huán)和噻喃環(huán)對復(fù)合物的影響不顯著。

2.2 細(xì)胞毒性

低細(xì)胞毒性是化合物作為理想非病毒基因載體的先決條件，采用MTT法檢測化合物Ⅲ、Ⅳ分別對細(xì)胞Hep3B、HepG2、Huh7作用24 h和48 h后的細(xì)胞毒性，以黃金標(biāo)準(zhǔn)PEI作為對照，結(jié)果見圖3。

圖3 化合物Ⅲ、Ⅳ、PEI對Hep3B、HepG2、Huh7的細(xì)胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of compounds Ⅲ,Ⅳ,and PEI to cells Hep3B,HepG2,and Huh7

由圖3可知，作用24 h后，化合物Ⅲ、Ⅳ與PEI相比，在較低濃度下細(xì)胞毒性無明顯差異；在濃度大于6.25 μg·mL-1時，PEI處理組的細(xì)胞存活率整體偏高，而化合物Ⅲ、Ⅳ處理組的細(xì)胞存活率顯著降低，說明化合物Ⅲ、Ⅳ存在較高的細(xì)胞毒性；同時發(fā)現(xiàn)，作用24 h后，化合物Ⅲ、Ⅳ對Hep3B、HepG2的細(xì)胞毒性大于Huh7細(xì)胞。作用48 h后，細(xì)胞存活情況與作用24 h的結(jié)果相似。

2.3 細(xì)胞攝取能力

細(xì)胞HepG2在用化合物Ⅲ、Ⅳ、PEI與gWiz-GFP-Cy5生成的復(fù)合物處理4 h后，細(xì)胞經(jīng)過固定、打孔、細(xì)胞核染色，其中細(xì)胞核用DAPI藍(lán)色染色(激發(fā)波長359 nm，發(fā)射波長461 nm)，gWiz-GFP用 Cy5紅色熒光標(biāo)記(激發(fā)波長646 nm，發(fā)射波長664 nm)。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞對復(fù)合物的攝取情況，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，PEI處理組在N/P為10/1時，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，有明顯的紅色熒光分布在藍(lán)色細(xì)胞核周圍，證明實驗條件下，PEI攜帶質(zhì)粒DNA進入細(xì)胞內(nèi)；化合物Ⅲ、Ⅳ處理組在S/P為40/1時，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)皺縮，出現(xiàn)細(xì)胞脫落破損，細(xì)胞內(nèi)無明顯紅色熒光。這是由于，在S/P為40/1時，烷基锍類化合物具有較高的細(xì)胞毒性，對細(xì)胞存在較強的殺傷能力，致使細(xì)胞無法有效攝取復(fù)合物。嘗試使用復(fù)合物處理細(xì)胞2 h、1 h或降低DNA用量至100 ng·μL-1，觀察細(xì)胞攝取情況，均未見明顯改善?；衔镏酗痴x子對細(xì)胞的毒性限制了其轉(zhuǎn)載DNA的效果，化合物結(jié)構(gòu)仍需進一步優(yōu)化。

(a) PEI/gWiz-GFP-Cy5，N/P=10/1 (b) Ⅲ/gWiz-GFP-Cy5，S/P=40/1 (c) Ⅳ/gWiz-GFP-Cy5，S/P=40/1圖4 HepG2細(xì)胞攝取結(jié)果Fig.4 Uptake results of HepG2 cells

3 結(jié)論

研究了烷基锍類化合物作為基因載體的性能，結(jié)果表明，4個烷基锍類化合物與質(zhì)粒DNA在硫磷比(S/P)為40/1、50/1時形成復(fù)合物的粒徑均在160～210 nm之間；烷基鏈較短(C12)時，復(fù)合物的Zeta電位為負(fù)值，烷基鏈較長(C16)時，復(fù)合物的Zeta電位為正值，在+20 mV左右；細(xì)胞毒性檢測結(jié)果顯示，在較低濃度下，烷基锍類化合物與PEI相比，細(xì)胞毒性無明顯差異，在濃度大于6.25 μg·mL-1時，烷基锍類化合物的細(xì)胞毒性強于PEI；細(xì)胞攝取能力檢測結(jié)果顯示，在S/P為40/1時，HepG2細(xì)胞存活狀態(tài)較差，不能有效攝取復(fù)合物。烷基锍類化合物具有作為基因載體的潛力，后續(xù)仍需優(yōu)化結(jié)構(gòu)，進一步降低細(xì)胞毒性，完成基因傳遞作用。