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烷基锍類化合物與DNA復(fù)合物的性質(zhì)研究

2022-02-13 04:33:50賴恩銘陳文洋
化學(xué)與生物工程 2022年1期
關(guān)鍵詞:烷基類化合物復(fù)合物

張 雷,張 瑩,賴恩銘,陳文洋,周 林,李 婧

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

基因治療是通過遞送外源正?;蜻M入靶細(xì)胞,改變?nèi)毕莼蛐蛄羞_到治療目的的醫(yī)用方法[1-2],其關(guān)鍵在于選擇合適的遞送載體。非病毒載體由于具有制備簡單、低免疫原性、低毒性和可生物降解等優(yōu)點,成為研究較為廣泛的遞送載體[3-4]。非病毒載體納米級別的粒徑有助于實現(xiàn)載體的靶向性和有效性。研究[5-6]發(fā)現(xiàn),復(fù)合物顆粒的粒徑達到一定尺寸時,能夠通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞,并且真核細(xì)胞中網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用具有顯著的顆粒尺寸依賴性。顆粒表面Zeta電位也是影響內(nèi)吞作用的一個因素,Zeta電位為正的顆粒容易吸附在細(xì)胞膜表面,進而促進內(nèi)吞作用。

目前,研究的非病毒載體主要包括陽離子多聚物、納米顆粒及陽離子脂質(zhì)體等[3,7]。其中,陽離子脂質(zhì)體的正電荷頭部能夠與質(zhì)粒DNA上的負(fù)電性磷酸根靜電吸引,疏水脂肪鏈尾部能將質(zhì)粒DNA縮聚為球狀粒子,這些特點引起了許多研究者的興趣[8-11]。作者所在課題組前期合成了一類烷基锍類化合物[12](圖1a),由于該類化合物含有锍正離子和疏水脂肪鏈,從而具備了復(fù)合質(zhì)粒DNA的能力?;衔铫窈廷蚝蠧12烷基鏈,在硫磷比(S/P)為40/1、50/1時顯示出弱阻滯效果;化合物Ⅲ、Ⅳ含有C16烷基鏈,在S/P 為30/1時顯示出弱阻滯效果,在S/P 為40/1、50/1時顯示出較好的阻滯效果(圖1b)。

圖1 烷基锍類化合物的結(jié)構(gòu)式(a)及烷基锍類化合物與gWiz-GFP質(zhì)粒復(fù)合后的凝膠阻滯電泳圖譜(b)Fig.1 Structural formula of alkyl-sulfonium compound(a) and electrophoretic mobility shift assay spectra(b) of alkyl-sulfonium compound and plasmid gWiz-GFP condensates

為深入研究烷基锍類化合物作為基因載體的性能,作者通過動態(tài)光散射實驗測定化合物Ⅰ~Ⅳ與質(zhì)粒DNA復(fù)合物的粒徑和Zeta電位,通過MTT法研究化合物Ⅰ~Ⅳ的細(xì)胞毒性,通過熒光顯微鏡觀察復(fù)合物的細(xì)胞攝取情況,為烷基锍類化合物基因載體的設(shè)計與轉(zhuǎn)染能力提升提供基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

人肝癌細(xì)胞株 Hep3B、HepG2、Huh7,購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC),本實驗室長期凍存?zhèn)鞔囵B(yǎng)。

烷基锍類化合物Ⅰ~Ⅳ,自制。乙腈、二甲基亞砜(DMSO),分析純,泉瑞試劑公司;蛋白胨、酵母粉、氯化鈉,Oxoid 公司;卡那霉素,Biosharp公司;DH-5α,TIANGEN 公司;gWiz-GFP質(zhì)粒,Aldevron 公司;EndoFree Plasmid Mega Kit,Qiagen公司;噻唑藍(lán)(MTT)胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液(100×),Solarbio公司;DMEM/F12 高糖培養(yǎng)基,Thermo Fisher 公司;聚乙烯亞胺(PEI,25 kDa),Sigma公司;胎牛血清,四季青公司;Label IT Cy5標(biāo)記試劑盒,Mirus Bio公司。

Nano-ZS ZEN型激光粒度儀,Malvern公司;Thermo Nanodrop 2000C 型分光光度計,Thermo Scientific公司;ELX800型全自動酶標(biāo)儀,BioTek Instruments 公司;Leica DMI 4000B型顯微鏡。

1.2 溶液的配制

gWiz-GFP質(zhì)粒DNA通過大腸桿菌進行擴增并提取[12]。

用乙腈將化合物Ⅰ~Ⅳ配制成30 nmol·μL-1的溶液,將gWiz-GFP質(zhì)粒配制成25 ng·μL-1的溶液,用于復(fù)合物粒徑、Zeta 電位的測定。

用DMSO將化合物Ⅲ、Ⅳ和PEI倍數(shù)稀釋成31.25 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、1.25 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1等5個濃度,用于MTT法細(xì)胞毒性檢測。

用DMSO將化合物Ⅲ、Ⅳ配制成10 nmol·μL-1的溶液,將PEI配制成6 nmol·μL-1的溶液。將gWiz-GFP質(zhì)粒配制成100 ng·μL-1的溶液后,使用試劑盒進行Cy5標(biāo)記。用于復(fù)合物細(xì)胞攝取能力檢測。

1.3 復(fù)合物粒徑、Zeta 電位的測定

分別取化合物溶液(3.3 μL、4.1 μL )與雙蒸水(28.7 μL、27.9 μL)混合成32 μL體系溶液;分別加入gWiz-GFP質(zhì)粒32 μL(800 ng),漩渦振蕩 10 s 后,室溫靜置20 min,形成S/P為40/1、50/1的化合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物,將復(fù)合物用雙蒸水稀釋至1 mL,采用激光粒度儀測定其粒徑、Zeta 電位。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞傳代:人肝癌細(xì)胞株 Hep3B、HepG2、Huh7分別用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(10%FBS培養(yǎng)液)培養(yǎng),待10 cm培養(yǎng)皿長滿90%細(xì)胞后,吸棄培養(yǎng)液,用8 mL PBS緩沖液清洗細(xì)胞,吸棄PBS緩沖液,用1 mL胰蛋白酶消化細(xì)胞1 min,加入9 mL 10%FBS培養(yǎng)液阻斷消化,用移液槍將貼壁細(xì)胞吹下,1 000 r·min-1離心3 min;吸棄上清,加入10 mL 10%FBS培養(yǎng)液,移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞,按1∶3的比例傳代。

細(xì)胞培養(yǎng):取第三代對數(shù)生長期的細(xì)胞,用細(xì)胞計數(shù)法計數(shù)。取適量細(xì)胞,以每孔200 μL 10%FBS培養(yǎng)液接種于96孔板中;置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h以上直至細(xì)胞貼壁;隨后將細(xì)胞培養(yǎng)液置換成200 μL 1%FBS血清培養(yǎng)液或無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)至觀測時間。

1.5 MTT法細(xì)胞毒性檢測

于96孔板中,接種200 μL密度為每孔8 000個的細(xì)胞,培養(yǎng)8 h至貼壁;取配制好的不同濃度化合物Ⅲ、Ⅳ和PEI溶液加入到96孔板中,每孔加樣量為1 μL(空白孔加入DMSO),最終上樣濃度(μg·mL-1)分別為0、0.01、0.25、1.25、6.25、31.25;將處理好的96孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h后,棄去培養(yǎng)液,每孔加入90 μL不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,再加入10 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液,繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)液,每孔(包括空白孔)加入150 μL DMSO,水平搖床振蕩10~20 min,用酶標(biāo)儀測定490 nm處每孔的吸光度,計算細(xì)胞存活率。

1.6 復(fù)合物細(xì)胞攝取能力檢測

將細(xì)胞爬片置于24孔板中,接種500 μL密度為每孔40 000個的細(xì)胞,培養(yǎng)8 h至貼壁。取化合物溶液9.8 μL與DMEM/F12高糖培養(yǎng)基40.2 μL混合成50 μL溶液。取參照PEI溶液4 μL與DMEM/F12高糖培養(yǎng)基46 μL混合成50 μL溶液。取Cy5標(biāo)記的質(zhì)粒DNA (8 μL,100 ng·μL-1)與DMEM/F12高糖培養(yǎng)基42 μL混合成50 μL溶液,以質(zhì)粒DNA輕輕加入化合物的方式制備成100 μL的復(fù)合物溶液。避光靜置30 min后,加入到24孔板中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,并用PBS緩沖液洗滌3次,每次8 min;加入4%多聚甲醛溶液靜置30 min,進行細(xì)胞固定,用PBS緩沖液洗滌3次,每次10 min;加入1%曲拉通溶液靜置20 min,進行細(xì)胞膜打孔,用PBS緩沖液洗滌3次,每次15 min;用含DAPI的封片劑將細(xì)胞爬片固定在載玻片上,進行細(xì)胞核染色,在熒光顯微鏡下觀察熒光分布情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合物的粒徑和Zeta電位(圖2)

圖2 復(fù)合物的粒徑(a)和Zeta電位(b)Fig.2 Particle size(a) and Zeta potential(b) of condensates

烷基锍類化合物的正電荷頭部與質(zhì)粒DNA中電負(fù)性磷酸根靜電吸引,疏水脂肪鏈尾部能將質(zhì)粒DNA縮聚成納米顆粒,適合尺寸的納米顆粒會通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞,Zeta電位為正的顆粒更容易吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,加快內(nèi)吞作用。由圖2a可知,4個化合物與質(zhì)粒DNA在S/P為40/1、50/1形成的復(fù)合物,粒徑均在160~210 nm之間。由圖2b可知,烷基鏈的長度明顯影響復(fù)合物的Zeta電位,烷基鏈越長對質(zhì)粒DNA的復(fù)合能力越強?;衔铫?、Ⅱ與質(zhì)粒DNA在S/P比為40/1和50/1形成的復(fù)合物,Zeta電位均為負(fù)值;化合物Ⅲ、Ⅳ與質(zhì)粒DNA在S/P為40/1和50/1形成的復(fù)合物,Zeta電位均在+20 mV左右。另外,噻吩環(huán)和噻喃環(huán)對復(fù)合物的影響不顯著。

2.2 細(xì)胞毒性

低細(xì)胞毒性是化合物作為理想非病毒基因載體的先決條件,采用MTT法檢測化合物Ⅲ、Ⅳ分別對細(xì)胞Hep3B、HepG2、Huh7作用24 h和48 h后的細(xì)胞毒性,以黃金標(biāo)準(zhǔn)PEI作為對照,結(jié)果見圖3。

圖3 化合物Ⅲ、Ⅳ、PEI對Hep3B、HepG2、Huh7的細(xì)胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of compounds Ⅲ,Ⅳ,and PEI to cells Hep3B,HepG2,and Huh7

由圖3可知,作用24 h后,化合物Ⅲ、Ⅳ與PEI相比,在較低濃度下細(xì)胞毒性無明顯差異;在濃度大于6.25 μg·mL-1時,PEI處理組的細(xì)胞存活率整體偏高,而化合物Ⅲ、Ⅳ處理組的細(xì)胞存活率顯著降低,說明化合物Ⅲ、Ⅳ存在較高的細(xì)胞毒性;同時發(fā)現(xiàn),作用24 h后,化合物Ⅲ、Ⅳ對Hep3B、HepG2的細(xì)胞毒性大于Huh7細(xì)胞。作用48 h后,細(xì)胞存活情況與作用24 h的結(jié)果相似。

2.3 細(xì)胞攝取能力

細(xì)胞HepG2在用化合物Ⅲ、Ⅳ、PEI與gWiz-GFP-Cy5生成的復(fù)合物處理4 h后,細(xì)胞經(jīng)過固定、打孔、細(xì)胞核染色,其中細(xì)胞核用DAPI藍(lán)色染色(激發(fā)波長359 nm,發(fā)射波長461 nm),gWiz-GFP用 Cy5紅色熒光標(biāo)記(激發(fā)波長646 nm,發(fā)射波長664 nm)。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞對復(fù)合物的攝取情況,結(jié)果見圖4。

由圖4可知,PEI處理組在N/P為10/1時,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,有明顯的紅色熒光分布在藍(lán)色細(xì)胞核周圍,證明實驗條件下,PEI攜帶質(zhì)粒DNA進入細(xì)胞內(nèi);化合物Ⅲ、Ⅳ處理組在S/P為40/1時,多數(shù)細(xì)胞形態(tài)皺縮,出現(xiàn)細(xì)胞脫落破損,細(xì)胞內(nèi)無明顯紅色熒光。這是由于,在S/P為40/1時,烷基锍類化合物具有較高的細(xì)胞毒性,對細(xì)胞存在較強的殺傷能力,致使細(xì)胞無法有效攝取復(fù)合物。嘗試使用復(fù)合物處理細(xì)胞2 h、1 h或降低DNA用量至100 ng·μL-1,觀察細(xì)胞攝取情況,均未見明顯改善?;衔镏酗痴x子對細(xì)胞的毒性限制了其轉(zhuǎn)載DNA的效果,化合物結(jié)構(gòu)仍需進一步優(yōu)化。

(a) PEI/gWiz-GFP-Cy5,N/P=10/1 (b) Ⅲ/gWiz-GFP-Cy5,S/P=40/1 (c) Ⅳ/gWiz-GFP-Cy5,S/P=40/1圖4 HepG2細(xì)胞攝取結(jié)果Fig.4 Uptake results of HepG2 cells

3 結(jié)論

研究了烷基锍類化合物作為基因載體的性能,結(jié)果表明,4個烷基锍類化合物與質(zhì)粒DNA在硫磷比(S/P)為40/1、50/1時形成復(fù)合物的粒徑均在160~210 nm之間;烷基鏈較短(C12)時,復(fù)合物的Zeta電位為負(fù)值,烷基鏈較長(C16)時,復(fù)合物的Zeta電位為正值,在+20 mV左右;細(xì)胞毒性檢測結(jié)果顯示,在較低濃度下,烷基锍類化合物與PEI相比,細(xì)胞毒性無明顯差異,在濃度大于6.25 μg·mL-1時,烷基锍類化合物的細(xì)胞毒性強于PEI;細(xì)胞攝取能力檢測結(jié)果顯示,在S/P為40/1時,HepG2細(xì)胞存活狀態(tài)較差,不能有效攝取復(fù)合物。烷基锍類化合物具有作為基因載體的潛力,后續(xù)仍需優(yōu)化結(jié)構(gòu),進一步降低細(xì)胞毒性,完成基因傳遞作用。

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