鮑小棟，方杰，金俊華，鄭桂茹

1.金華市人民醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 金華 321000；2.杭州醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 杭州 310063

以肝細(xì)胞癌為主的原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在所有腫瘤疾病患者中約占5.6%[1-4]。在世界范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率位居第5位，其病死率更是位列第3位；每年全球新增肝癌患者約為62.6萬人，其中發(fā)展中國家的肝癌發(fā)病率要高于發(fā)達(dá)國家[4-5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生時(shí)肝臟已經(jīng)受到嚴(yán)重?fù)p傷，且肝癌細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移能力和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，使得肝癌的治療一直是臨床上面臨的重要難題。中醫(yī)藥是我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，在肝癌的預(yù)防和治療方面發(fā)揮著重要的作用。蛇床子素為香豆素類代表化合物，化學(xué)名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，來源于傳統(tǒng)中藥蛇床子[6-9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素對(duì)心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面的疾病均具有治療效果[10]。近年來，隨著對(duì)蛇床子素研究的深入，多項(xiàng)體外研究實(shí)驗(yàn)表明，蛇床子素對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出一定的抗增殖作用[11-14]。蛇床子素作為一種低毒、具有抗腫瘤效應(yīng)的天然產(chǎn)物提取物和先導(dǎo)化合物，其廣泛的抗腫瘤作用雖然已被證實(shí)，但其抗肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲的作用效果及抗肝癌相關(guān)機(jī)制仍不清楚，尚需進(jìn)一步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721和Bel-7402均購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，于液氮中保存，使用前復(fù)蘇。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件，待細(xì)胞貼壁生長2～3 d后采用胰蛋白酶消化傳代，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代2～3代后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑：蛇床子素（純度＞99%，CAS號(hào)：484-12-8）和二甲基亞砜（DMSO，純度＞99.9%，CAS號(hào)：67-68-5）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，蛇床子素完全溶于DMSO中配制成終濃度為 10 mmol/L備用。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）（CAS號(hào)：77180-80-4，購自上海藍(lán)木化工有限公司，10 mmol/L溶解于1 mL DMSO中）。DMEM完全培養(yǎng)基購自杭州喬陽生物科技有限公司，含0.25% EDTA胰酶、青鏈霉素購自武漢普諾賽生物科技有限公司，胎牛血清購自湖州天杭生物科技股份有限公司，鈣黏蛋白E（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、微管蛋白（tublin）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自杭州昕誠生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)：用胰蛋白酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以每孔1×104個(gè)的密度接種于96孔板中孵育24 h，待細(xì)胞完全貼壁。加入配制好的蛇床子素藥液使終給藥濃度分別為50、100、150、200 μmol/L。在對(duì)照組中，相同培養(yǎng)條件下不加蛇床子素。設(shè)置6個(gè)復(fù) 孔。培養(yǎng)48 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸去上清液，添加DMSO 150 μL，微量振蕩器振蕩2 min至完全溶解。在570 nm波長處檢測吸光度值（OD值），并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.2.2 集落形成實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于6孔板中，每孔含細(xì)胞1×103個(gè)。在培養(yǎng)基中加入蛇床子素藥液和陽性對(duì)照藥5-FU，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。孵育4 d后倒置顯微鏡下以直徑大于0.5 mm觀察集落數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：設(shè)置蛇床子素給藥組、空白組，將細(xì)胞接種到6孔板中，待生長至80%匯合度時(shí)，除去培養(yǎng)基，用20 μL移液槍頭末端刮擦產(chǎn)生劃痕，加入培養(yǎng)基，給藥組同時(shí)給予蛇床子素藥液，空白組加入等量DMSO溶液，分別孵育48 h和72 h后，在電子顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，使用計(jì)算機(jī)輔助電子測量并量化6個(gè)隨機(jī)視野中每個(gè)視野中遷移到劃痕區(qū)域的細(xì)胞。

1.2.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)：使用24孔Transwell板，在Transwell上室中涂0.25 mg/mL Matrigel膠。用不同濃度的蛇床子素藥液（50、100 μmol/L） 與等量的DMSO處理SMMC-7721細(xì)胞24 h，予胰蛋白酶消化并接種到100 μL無血清培養(yǎng)基中的上部Transwell小室中，每個(gè)2×104個(gè)細(xì)胞。在下室中加入600 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基中，使細(xì)胞在含5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中在37 ℃下通過過濾器遷移48 h，將附著于膜下表面的細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，并予結(jié)晶紫染色，用棉簽擦拭除去過濾器表面的細(xì)胞，在200倍下隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)過濾器表面上的染色細(xì)胞數(shù)及拍照。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)：將人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721經(jīng)不同濃度的蛇床子素藥液（50、100、150 μmol/L）處理48 h后，用蛋白胰酶消化并離心以沉淀細(xì)胞，加入裂解緩沖液，然后用超聲波粉碎儀在冰上裂解細(xì)胞。在4 ℃，轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心20 min。取上清液，測定蛋白質(zhì)濃度，并保存在-80 ℃冰箱中。將樣品蛋白質(zhì)加入等體積緩沖液，混合并煮沸5 min以使蛋白質(zhì)變性并通過凝膠電泳將其分離。轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人tubulin-3、MMP-2和E-cadherin抗體（1:1 000） 4 ℃下過夜。采用羊抗兔二抗（1:2 000）室溫孵育1 h，洗膜3次，用凝膠成像儀掃描成像，使用ImageJ軟件分析條帶，以目的蛋白平均光密度/tubulin-3平均光密度反映目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Pro統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)不少于3次。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞活力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50、100、150、200 μmol/L的蛇床子素藥液處理人肝癌HepG2、SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞48 h后，與空白組相比，蛇床子素各劑量組均呈現(xiàn)出抑制人肝癌細(xì)胞生長的效應(yīng)，細(xì)胞活力顯著降低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，且具有良好的IC50值，見圖1。

圖1 蛇床子素化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)HepG2、SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞活力的影響

2.2 蛇床子素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402增殖能力的影響 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比，50、75、100 μmol/L蛇床子素組細(xì)胞克隆增殖菌落均顯著減少（P＜0.05），呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，見圖2。對(duì)于人肝癌HepG2細(xì)胞， 75 μmol/L蛇床子素即表現(xiàn)出顯著的抑制效果，而SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞，則在100 μmol/L表現(xiàn)出與 陽性對(duì)照藥物5-FU（1 mg/mL）相似的抑制增殖能力。

圖2 蛇床子素對(duì)HepG2、SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 蛇床子素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7402遷移和侵襲能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比，蛇床子素（100 μmol/L）組細(xì)胞在48 h、72 h遷移距離明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。SMMC-7721細(xì)胞的 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比， 50 μmol/L蛇床子素組和100 μmol/L蛇床子素組SMMC-7721細(xì)胞從上腔到下腔的遷移率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 Transwell法測定蛇床子素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 蛇床子素對(duì)MMP-2和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明，與空白組比，在蛇床子素50、100、150 μmol/L影響下，人肝癌細(xì)胞HepG2與SMMC-7721中MMP-2蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。見圖5。

圖5 蛇床子素對(duì)HepG2及SMMC-7721中MMP-2、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

3 討論

蛇床子素具有抗炎[15]、抗菌[16]、抗骨質(zhì)疏 松[17]、抗氧化[18]、增強(qiáng)免疫力[19]等多種藥理學(xué)作用。蛇床子素作為一種低毒、高效的具有抗腫瘤效應(yīng)的天然產(chǎn)物提取物和先導(dǎo)化合物，在抗肝癌藥物的研究中受到越來越多研究者的關(guān)注，具有極其廣闊的應(yīng)用前景。HepG2、SMMC-7721和Bel-7704均來源于人肝癌細(xì)胞株，常被應(yīng)用于新型肝癌治療手段和治療藥物的研究。因此，為了探究蛇床子素是否在體外具有抗肝癌作用，本研究利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的蛇床子素（50、100、150、200 μmol/L）在體外均可抑制人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721和Bel-7704的細(xì)胞活力，呈現(xiàn)濃度依賴性。同時(shí)利用細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了蛇床子素組具有抑制人肝癌細(xì)胞體外增殖的效果，且在蛇床子素100 μmol/L的濃度條件下，給藥組表現(xiàn)出了與5-FU（1 mg/mL）相似的抑制效果，證實(shí)了蛇床子素確實(shí)具有抗肝癌的生物活性。

肝癌細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移能力和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，使得肝癌的藥物治療一直存在挑戰(zhàn)[20-21]。本研究利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)蛇床子素對(duì)于人肝癌細(xì)胞遷移侵襲作用的影響，在電子顯微鏡下可以觀察到100 μmol/L的蛇床子素在48 h和72 h可以明顯抑制人肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，且在人肝癌細(xì)胞中高表達(dá)[22-24]。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition, EMT）相關(guān)蛋白E-cadherin 可以保持完整的細(xì)胞連接，激活E-cadherin蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。為了進(jìn)一步探究蛇床子素抑制人肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的藥理機(jī)制，本研究利用Western blot實(shí)驗(yàn)，在分子水平上驗(yàn)證了蛇床子素可以抑制HepG2和SMMC-7721中細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2的表達(dá)以及激活EMT相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)。這提示蛇床子素抑制人肝癌侵襲的作用可能與抑制MMP-2表達(dá)以及增加E-cadherin表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究采取天然產(chǎn)物蛇床子素作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其體外具有抑制人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用，其抑制侵襲作用機(jī)制可能與抑制人肝癌細(xì)胞中MMP-2蛋白和激活E-cadherin蛋白有關(guān)，有望為肝癌的治療提供新的藥物和新的治療方法。