李冰冰 謝苗 郭亞楠 和翔宇 劉雁峰

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)為子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮以外的部位出現(xiàn)、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)，反復(fù)出血，繼而引發(fā)疼痛、不孕及結(jié)節(jié)或包塊等[1]。卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫(又稱巧克力囊腫)的形成是由種植于卵巢表面的子宮內(nèi)膜組織向卵巢皮質(zhì)的浸潤(rùn)內(nèi)陷生長(zhǎng)，在卵巢激素的影響下，異位內(nèi)膜周期性出血，逐漸長(zhǎng)大形成假囊，向卵巢深部擴(kuò)張，壓迫周圍卵巢組織，誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)，伴纖維細(xì)胞增生及纖維化[2]。研究[3]顯示巧克力囊腫囊壁中存在的致密纖維化帶，增加了手術(shù)過(guò)程中囊腫與卵巢的剝離困難程度，同樣也導(dǎo)致了剝離正常卵巢組織的風(fēng)險(xiǎn)。所以巧克力囊腫對(duì)卵巢功能損傷的主要原因，一是異位病灶本身對(duì)卵巢皮質(zhì)的浸潤(rùn)直接損傷了卵巢組織，異位囊腫的壓迫和周圍纖維化的形成和炎癥反應(yīng)又影響了卵巢的正常血供；再者就是異位囊壁中致密纖維化帶的存在增加了手術(shù)剝離的困難，導(dǎo)致剝離時(shí)難免攜帶正常卵巢組織[4-5]。

目前關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥纖維化形成的機(jī)制尚不清楚，TGF-β1是引發(fā)纖維化形成的關(guān)鍵因子，可通過(guò)Smads蛋白家族的介導(dǎo)引發(fā)致纖維作用，研究顯示在多種纖維化疾病中起著重要的作用[6-8]。本研究采集巧克力囊腫患者異位囊腫囊壁組織、在位內(nèi)膜和其它卵巢良性腫瘤患者的內(nèi)膜組織，通過(guò)檢測(cè)三種組織纖維化形成情況及TGF-β1、Smads的表達(dá)水平，初步探討TGF-β1、Smads在EMs中的表達(dá)和意義。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2016年9月至2019年1月收治的巧克力囊腫腹腔鏡手術(shù)患者20例(Ⅲ～Ⅳ期)，取其卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁組織作為卵巢異位癥囊壁組，對(duì)于其中9例行宮腹腔鏡聯(lián)合手術(shù)的患者，再取其在位內(nèi)膜組織作為子宮在位內(nèi)膜組；同時(shí)期因其他卵巢良性腫瘤行宮腹腔鏡聯(lián)合術(shù)者9例，取其子宮內(nèi)膜組織作為子宮內(nèi)膜對(duì)照組。所有納入本研究的患者術(shù)后均經(jīng)病理明確診斷。

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20歲～49歲，未絕經(jīng)者；(2)術(shù)前均行彩超或者CT等影像學(xué)檢查，支持卵巢腫瘤的診斷；(3)病理檢查明確診斷為卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫或其他卵巢良性腫瘤。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前3個(gè)月內(nèi)接受激素治療；(2)合并有心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等疾病、精神病患者；(3)合并生殖道惡性腫瘤、乳腺癌等雌激素依賴性疾病、腫瘤或急性炎癥。

3. EMs診斷標(biāo)準(zhǔn)：EMs診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)子宮內(nèi)膜異位癥協(xié)作組制定的《子宮內(nèi)膜異位癥診治指南》[1]：經(jīng)腹腔鏡手術(shù)肉眼可見(jiàn)典型病灶，并結(jié)合病理檢查確診為EMs；病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：病灶中可見(jiàn)子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)，伴有炎癥反應(yīng)及纖維化。

二、方法

1.信息采集：所有研究對(duì)象采集年齡、月經(jīng)婚育史、現(xiàn)病史、既往病史及用藥史等信息。

2.樣本采集：巧克力囊腫患者共20例，術(shù)后采集其異位囊腫囊壁組織；其中有9例巧克力囊腫患者行宮腹腔鏡聯(lián)合術(shù)，同時(shí)采集其宮腔刮出物；其它行宮腹腔鏡聯(lián)合術(shù)的卵巢良性腫瘤患者9例，采集宮腔刮出物。將獲取的組織放置于多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定。

3.觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：以蘇木精和伊紅染色方法(HE染色法)染色，采用顯微鏡觀察卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜對(duì)照組的組織形態(tài)學(xué)；采用Masson染色法來(lái)判斷卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜對(duì)照組的纖維化形成情況；采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內(nèi)膜組、子宮內(nèi)膜對(duì)照組組織中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7的表達(dá)情況。專業(yè)圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus對(duì)三組的免疫組化切片進(jìn)行分析，以平均光密度值(MOD，MOD=IOD/Area)作為TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7表達(dá)強(qiáng)度的評(píng)價(jià)參數(shù),在200倍拍攝倍數(shù)下，每張切片隨機(jī)觀察3個(gè)視野,取平均值作為每張切片的觀察結(jié)果。

4.主要實(shí)驗(yàn)試劑：MASSON三色染色試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，BA-4079A)，一抗(Tgfb1)(Abcam,ab92486)，一抗(p-samd2/3)(Abcam,ab63399)，一抗(samd7)(Santa,sc-365846)。

5.主要實(shí)驗(yàn)器材：石蠟包埋機(jī)(沈陽(yáng)市龍首電子儀器有限公司，LS-100)，全景掃描儀(3DHISTECH，Pannoramic MIDI)，顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司，BA400)，攝像裝置(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司，Moticcam 2306)，成像軟件系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司，Motic Images Advanced 3.2)。

結(jié) 果

一、基線資料比較

卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內(nèi)膜組、子宮內(nèi)膜對(duì)照組患者的年齡、初潮年齡、月經(jīng)周期、妊娠史均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

表1 三組患者的基線資料

二、組織學(xué)表現(xiàn)

1.HE染色：子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜組織包含子宮內(nèi)膜腺體、子宮內(nèi)膜間質(zhì)、纖維素以及富含含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞等4種成分[2]。HE染色結(jié)果顯示，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫內(nèi)壁可見(jiàn)子宮內(nèi)膜樣上皮細(xì)胞，上皮層下可見(jiàn)內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，部分異位囊內(nèi)壁上皮細(xì)胞不完整、稀少；囊壁可見(jiàn)致密結(jié)締組織，存在纖維組織的增生，伴有間質(zhì)內(nèi)灶狀新鮮出血或陳舊出血。見(jiàn)圖1。

2. Masson染色：組織切片經(jīng)Masson染色后，鏡下觀察表現(xiàn)藍(lán)染區(qū)域?yàn)槔w維化。染色結(jié)果顯示卵巢異位癥囊壁組織內(nèi)均可見(jiàn)明顯的藍(lán)染區(qū)域，即表明纖維化沉積；而子宮在位內(nèi)膜組、對(duì)照內(nèi)膜組的組織中，均未見(jiàn)到明顯纖維化藍(lán)染區(qū)域。見(jiàn)圖1。

圖1 組織形態(tài)學(xué)

三、免疫組織化學(xué)結(jié)果

1.表達(dá)定位：TGF-β1、p-Smad2/3在卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜對(duì)照組中均有表達(dá)，主要表達(dá)在腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中；Smad7在卵巢異位癥囊壁組、子宮在位內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜對(duì)照組中均有表達(dá)，但在卵巢異位癥囊壁組表達(dá)較弱，主要表達(dá)在腺上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。見(jiàn)圖2。

2. 表達(dá)結(jié)果：卵巢異位癥囊壁組TGF-β1表達(dá)水平最高，但與子宮在位內(nèi)膜組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與子宮內(nèi)膜對(duì)照組之間表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性；子宮在位內(nèi)膜組TGF-β1平均表達(dá)水平高于子宮內(nèi)膜對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。卵巢異位癥囊壁組p-Smad2/3表達(dá)最高，但與子宮在位內(nèi)膜組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；子宮內(nèi)膜對(duì)照組p-Smad2/3表達(dá)最低，與卵巢異位癥囊壁和子宮在位內(nèi)膜組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。卵巢異位癥囊壁組Smad7的表達(dá)含量最低，與子宮在位內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；子宮在位內(nèi)膜組Smad7的表達(dá)含量較對(duì)照內(nèi)膜組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組免疫組化結(jié)果

討 論

巧克力囊腫異位病灶周期性的反復(fù)出血，囊內(nèi)壓力增大，異位囊腫逐漸浸潤(rùn)并壓迫附近的卵巢基質(zhì)，并刺激鄰近組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，逐漸造成周圍組織纖維化。因纖維化形成而致粘連，增加了手術(shù)剝離困難，從而增加了對(duì)卵巢功能的損傷。研究[3，9]顯示畸胎瘤囊壁中存在致密纖維化帶和疏松帶，而巧克力囊腫囊壁只存在致密的纖維化帶，且異位囊壁纖維化致密帶和卵巢皮質(zhì)的厚度均厚于畸胎瘤，致密纖維化帶應(yīng)該是增加手術(shù)剝離異位囊腫困難的原因，卵巢組織存在被攜帶剝離的可能。另一方面，異位病灶的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)導(dǎo)致了卵巢皮質(zhì)的損傷，從而對(duì)卵巢功能產(chǎn)生影響[10]。已有研究顯示巧克力囊腫卵巢組織中發(fā)生了纖維化和炎癥，繼而伴隨著血管化減少和氧化應(yīng)激增加[11]，這也可能是導(dǎo)致卵泡激活和隨后卵泡丟失的原因。

TGF-β1主要由巨噬細(xì)胞分泌，參與組織的纖維化作用，可促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加ECM的形成，能夠明顯地促進(jìn)纖維母細(xì)胞增生、膠原的沉積，在肺纖維化、肝纖維化和心臟纖維等疾病中均起著一定的致纖維化作用[6-8]。相較于野生型小鼠，TGF-β1缺失小鼠的子宮內(nèi)膜異位病變重量、腺上皮比例、巨噬細(xì)胞和α平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性肌成纖維細(xì)胞的豐度均降低[12]。高水平的TGF-β1是子宮內(nèi)膜異位癥異位病變發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，可增強(qiáng)子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞或組織的遷移、粘附、侵襲性和定殖潛力[13]。Smad介導(dǎo)的TGF-β1是引起纖維化的最重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一。Smad2和Smad3是受體調(diào)節(jié)型Smad，可被Ⅰ型受體直接磷酸化激活，p-Smad2/3和通用型Smad結(jié)合成多聚體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，然后調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄；Smad7作為抑制型Smad可阻止Smad信號(hào)傳導(dǎo)。研究[14]顯示Smad3在TGF-β1致肝纖維化疾病中發(fā)揮著重要作用，可促進(jìn)ECM的產(chǎn)生增加。Smad7還可以和TGF-β受體I競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而對(duì)Smad2或Smad3的磷酸化產(chǎn)生抑制，阻斷TGF-β信號(hào)的后續(xù)傳導(dǎo)[15]。

本研究結(jié)果顯示，與子宮內(nèi)膜對(duì)照組相比，卵巢異位癥囊壁組和子宮在位內(nèi)膜組TGF-β1的表達(dá)水平高，TGF-β1可促進(jìn)纖維母細(xì)胞增生、膠原沉積，導(dǎo)致內(nèi)異癥纖維化的形成。與對(duì)照內(nèi)膜組相比，卵巢異位癥囊壁組和子宮在位內(nèi)膜組中存在p-Smad2/3的高表達(dá)，而Smad7的表達(dá)相對(duì)低。研究結(jié)果推測(cè)p-Smad2/3參與子宮內(nèi)膜異位癥疾病，在促進(jìn)異位細(xì)胞增殖分化、血管生成和纖維化形成中起到一定的作用。作為抑制型的Smad7在異位囊壁和在位內(nèi)模組中的低表達(dá)，可能表明Smad7對(duì)Samd介導(dǎo)的TGF-β1信號(hào)通路抑制減弱，從而Smad介導(dǎo)TGF-β1信號(hào)通路的致纖維化作用增強(qiáng)，促進(jìn)了子宮內(nèi)膜異位癥纖維化的形成。TGF-β1/Smads通路在多種疾病的纖維化形成中起著關(guān)鍵作用，相關(guān)研究也逐漸證實(shí)，其在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用還有待深入的研究。纖維化形成是子宮內(nèi)膜異位癥的主要病理特點(diǎn)之一，以纖維化為切入點(diǎn)，可有望為子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制和治療的研究提供一個(gè)新的視角。