徐 凱, 劉鑫玟, 覃 昊, 張珍珍, 閻斌倫, 高 煥, 胡廣偉

脊尾白蝦抗菌肽基因的克隆、表達與功能研究

徐 凱1, 2, 劉鑫玟1, 2, 覃 昊1, 2, 張珍珍1, 2, 閻斌倫1, 2, 高 煥1, 2, 胡廣偉1, 2

(1. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室/江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 連云港 222005)

為研究脊尾白蝦()抗菌肽Crustin的結(jié)構(gòu)特征和功能, 本研究從脊尾白蝦中克隆得到一個Crustin的新變體, 命名為。研究結(jié)果表明,基因cDNA序列長度為740 bp, 開放閱讀框(ORF)長度為477 bp, 編碼158個氨基酸,蛋白具有Ⅱ型Crustin的典型特征, 包括N端的信號肽, C端WAP結(jié)構(gòu)域, 以及二者之間的甘氨酸富集區(qū)(GRR)和半胱氨酸富集區(qū)(CRR)?；蛑饕诩刮舶孜r血淋巴中表達, 副溶血弧菌刺激后,在血淋巴中的表達顯著上調(diào)(<0.05), 說明在脊尾白蝦先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。此外, 通過原核表達獲得了該抗菌肽的重組蛋白, 為進一步研究其抑菌功能和機理提供了基礎(chǔ)。

脊尾白蝦; 抗菌肽; Crustin; 基因克隆; 原核表達

近年來我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)一直處于穩(wěn)步發(fā)展態(tài)勢, 尤其是進入21世紀后, 中國堅持以養(yǎng)為主的發(fā)展方針, 有力地促進了中國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)朝著多品種、多模式、工廠化和集約化方向發(fā)展, 確定了世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國的地位。但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大, 水產(chǎn)動物病害頻發(fā)成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展的主要因素之一?？股仡愃幬锏氖褂檬悄壳八a(chǎn)動物病害防治的有效途徑, 但是長期過量使用抗生素類藥物會導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生抗藥性, 嚴重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康可持續(xù)發(fā)展, 此外, 藥物殘留還可能威脅人類健康?？咕?antimi-crobial peptides, AMPs)是一類自然界中普遍存在且具有廣譜抗菌活性的小分子多肽[1]。作為生物體自身免疫系統(tǒng)的重要組成部分, 抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高, 分子量小, 抗菌廣譜等特點, 對多數(shù)病原菌和寄生蟲等均表現(xiàn)出較好殺傷或抑制效果[2-3], 被譽為“天然抗生素”, 有望成為抗生素的天然替代品。

世界上第一個抗菌肽——天蠶素是由瑞典科學(xué)家在使用大腸桿菌感染惜古比天蠶蛾()時分離獲得[4], 目前已從水產(chǎn)動物中分離得到多種多樣的抗菌肽[5]。在甲殼動物中分離得到的抗菌肽主要有3種, 分別為抗脂多糖因子(anti-lipopo-lysac-charide factors, ALFs)、對蝦素(Penaeidins)和甲殼素(Crustins)[6]。Crustin是抗菌肽家族的重要成員, 作為一種陽離子抗菌肽, Crustin具有抗菌、抑制蛋白酶、促進傷口愈合等多種功能。目前已經(jīng)報道的Crustin主要有5種類型, 分別為Crustin Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型[7], 其區(qū)別主要在于氨基酸序列的組成不同。在甲殼動物中常見的主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型Crustin。Ⅰ型Crustin在鰲蝦和蟹類中均有報道, 抑菌實驗顯示, Ⅰ型Crustin對金黃色葡萄球菌()、芽孢桿菌和副溶血弧菌()等均具有一定的抑制作用[8-12]。Ⅱ型Crustin主要從對蝦中分離得到, 對副溶血性弧菌和對蝦白斑綜合征病毒(white spot syndromevirus, WSSV)均表現(xiàn)出較好的抑制作用[13], Ⅲ型Crustin對白班綜合征病毒具有明顯的抑制作用[14], Ⅳ型Crustin的抗菌活性目前還未見報道[15]。

脊尾白蝦()隸屬十足目(Decapoda)、長臂蝦科(Palaemonidae)、白蝦屬(), 是我國特有的3種經(jīng)濟蝦類之一, 養(yǎng)殖規(guī)模呈逐年上升的趨勢[16-17]。此外, 因脊尾白蝦軀體透明、生長快速、繁殖周期短、適應(yīng)性強等特點使其成為甲殼類研究的潛在模式生物[18]。本研究在前期脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)上, 克隆了一個脊尾白蝦基因的完整編碼序列(coding sequence, CDS)序列, 命名為, 并對其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系進行了分析, 在此基礎(chǔ)上分析了在脊尾白蝦不同組織及副溶血弧菌刺激后的表達情況, 最后利用基因工程手段構(gòu)建了的原核表達載體, 體外表達獲得了目的蛋白, 以期為進一步研究的作用機理及其在甲殼類中的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用脊尾白蝦來自連云港市佳信水產(chǎn)有限公司, 平均體長(5.35±0.26) cm, 體重(1.60±0.28) g, 實驗開始前將其暫養(yǎng)7 d, 暫養(yǎng)期間持續(xù)充氧, 每天換水1/3到1/2, 使氨氮控制在0.05 mg·L–1以下, 溫度控制在25～30 ℃, 鹽度保持在24～26, pH在7.0～8.0之間。

取樣時將脊尾白蝦置于冰上, 吸干殘留水分后用一次性注射器于脊尾白蝦圍心腔插入, 小心抽取血淋巴組織, 離心收集沉淀, 加入適量Trizol試劑, 混勻后于–80 ℃箱中保存?zhèn)溆?。采集血淋巴組織后將蝦殼分離, 迅速分離脊尾白蝦胃、鰓、腸道、肌肉及肝胰腺組織, 加入Trizol試劑, 勻漿后于–80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

總RNA提取方法參照RNA提取試劑盒說明書進行(Total RNA Extractor, 上海生工), 提取后利用Nanodrop 2000檢測RNA濃度, 使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。RNA樣品檢測合格后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR, Vazyme)說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 于–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的基因克隆與測序

根據(jù)實驗室前期獲得的脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計目的基因引物, 分別命名為Cru-F1和Cru-R1(具體信息見表1), 引物由上海生工生物工程有限公司合成。以脊尾白蝦cDNA為模板進行PCR, 擴增獲得目的基因CDS序列, 電泳檢測后利用膠回收試劑盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini kit, Vazyme )回收純化靶基因片段, 純化回收的目的PCR產(chǎn)物與載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中, 挑取陽性克隆, 送上海生工生物工程有限公司測序。

表1 實驗所用引物序列

注: 下劃線表示酶切位點

1.2.3 目的基因在組織中的表達分析

以脊尾白蝦不同組織cDNA為模板進行熒光定量PCR反應(yīng), 熒光定量PCR反應(yīng)按照試劑盒(SYBR Premix ExTMⅡ)說明書進行, 使用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行脊尾白蝦目的基因表達定量分析, 以18S rRNA為內(nèi)參基因[19]。目的基因與內(nèi)參基因定量引物見表1。擴增程序: 95 ℃預(yù)變性3 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 進行40個循環(huán)。利用2–ΔΔCt法計算目的基因在脊尾白蝦各組織中的相對表達量。

1.2.4 副溶血弧菌刺激后靶基因的表達分析

將脊尾白蝦分成2組, 對照組和實驗組(副溶血弧菌刺激), 實驗前將副溶血弧菌活化, 活化后測定濃度3.6×108CFU/mL, 按10 μL/只于第2節(jié)腹肢肌肉注射, 注射后分別在0、3、6、12、48、72 h(每組每個時間點隨機取3只)采集血淋巴組織并提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行熒光定量PCR, 分析副溶血弧菌刺激后目的基因的表達情況。

1.2.5 原核表達載體構(gòu)建及目的蛋白純化

設(shè)計含有酶切位點(EcoRⅠ/XhoⅠ)的引物, 分別命名為Cru-F3和Cru-R3, 具體信息見表1, 以脊尾白蝦cDNA為模板進行PCR, 擴增目的基因的完整CDS序列, 擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后利用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切, 酶切產(chǎn)物純化后與表達載體pET- 32a連接, 獲得重組質(zhì)粒pET-32a-Crustin, 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中表達, 挑取陽性克隆, 測序驗證后擴大培養(yǎng), 37 ℃條件下異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導(dǎo)表達, 培養(yǎng)4 h后, 采用離心方法收取細菌, 開展SDS-PAGE與western blot分析。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

利用DNAMan軟件對基因序列和氨基酸序列進行預(yù)測分析, 包括氨基酸組成、蛋白質(zhì)分子量、理論等電點。利用軟件MEGA 6.0對氨基酸序列進行同源比對, 利用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。同源序列在NCBI數(shù)據(jù)庫檢索獲得。利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)進行信號肽結(jié)構(gòu)預(yù)測, 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測利用SMART(http://smart.emblheidelverg.de/smart/set_ mode.cgi)進行。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

從脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中克隆得到1條基因序列, 將其命名為?？寺y序結(jié)果顯示基因序列長度為740 bp, 開放閱讀框(ORF)長度為477 bp, 編碼158個氨基酸, 所編碼氨基酸序列分子量為16 kDa, 理論等電點為7.8。編碼蛋白具有Crustins家族的典型結(jié)構(gòu)特征, 包括N-端的信號肽序列和C-端的乳清酸蛋白(whey acidic protein, WAP)結(jié)構(gòu)域(圖1),成熟肽含有12個保守的半胱氨酸, 其中8個在WAP結(jié)構(gòu)域中。

圖1 脊尾白蝦EcCrustin1序列分析

注:基因序列及其編碼的氨基酸序列, 單下劃線表示信號肽序列, 雙下劃線表示甘氨酸富集區(qū)(GRR), 方框表示半胱氨酸富集區(qū)(CRR), WAP結(jié)構(gòu)域用灰色背景標出, 12個保守半胱氨酸用紅色字體表示, 星號表示終止密碼子, 加尾信號用斜體字母表示。

在NCBI網(wǎng)站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上用BLAST對比分析基因, 選出與脊尾白蝦基因序列相似性較高的Crustin氨基酸序列, 然后用DNAMan 6.0進行多重序列比對, 結(jié)果如圖2所示, 脊尾白蝦氨基酸序列與氨基酸序列同源性最高, 為24.54%, 與氨基酸序列、氨基酸序列、氨基酸序列、氨基酸序列的同源性分別為22.69%、22.22%、21.76%和20.83%。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果如圖3所示, 脊尾白蝦與擬穴青蟹()親緣關(guān)系最近, 單獨聚為一支, 其他物種的Crustin聚為另一大支。

圖2 EcCrutin1氨基酸序列與其他甲殼動物同型Crustin的序列比對

注::;:;:;:;:;:

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圖3 基于EcCrustin1氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

注::;:;:;:;:;:;:;:;:

2.2 脊尾白蝦EcCrustin1基因在組織中的表達情況

以18S rRNA為內(nèi)參基因, 利用實時定量熒光PCR方法分析了基因在脊尾白蝦胃、血淋巴、鰓、腸、肌肉和肝胰腺中表達情況, 結(jié)果如圖4所示, 尾白蝦基因在上述6種組織中都有表達, 但相對表達水平存在差異, 其中基因在血淋巴中表達量最高且與其他組相比差異顯著(0.05), 在肌肉組織中表達量最低。

圖4 EcCrustin1在不同組織中的表達情況

注: 不同小寫字母表示的表達量在不同組織中差異顯著(<0.05)

2.3 副溶血弧菌刺激后靶基因的表達變化

為研究脊尾白蝦中基因?qū)χ虏【膽?yīng)答情況, 本研究利用副溶血弧菌刺激脊尾白蝦, 刺激后于不同時間點檢測血淋巴中靶基因的表達情況, 結(jié)果如圖5所示, 副溶血弧菌刺激后的表達量顯著上調(diào)(<0.05), 在刺激后6 h達到峰值, 48 h后回落至對照組水平。

圖5 副溶血弧菌刺激后EcCrustin1在血淋巴中的表達情況

注: 不同小寫字母表示表達量差異顯著(<0.05)

2.4 蛋白表達及抑菌活性分析

利用1.2.5中描述方法成功構(gòu)建了脊尾白蝦的原核表達系統(tǒng), 通過菌落PCR和測序驗證了重組質(zhì)粒的正確性。在此基礎(chǔ)上對重組質(zhì)粒進行誘導(dǎo)表達, 結(jié)果如圖6所示, IPTG終濃度為0.5 mM,37 ℃培養(yǎng)4 h后得到一條18 kDa的條帶, western blot結(jié)果顯示為目的蛋白?？扇苄苑治鼋Y(jié)果顯示目的蛋白不可溶, 以包涵體形式存在, 進一步放大純化, 復(fù)性后得到目的蛋白。對目的蛋白進行體外抑菌活性實驗, 發(fā)現(xiàn)目的蛋白對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌無明顯的抑菌效果。

圖6 蛋白體外誘導(dǎo)表達與純化結(jié)果

注: M為蛋白marker, 1為未加IPTG, 2～6加入不同濃度IPTG, 下劃線表示目的蛋白條帶

3 討論

3.1 脊尾白蝦EcCrustin1的結(jié)構(gòu)特點

甲殼素是甲殼動物抗菌肽家族的重要成員之一, 在機體抵抗病原入侵的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用, 典型的甲殼素一般都包含3個功能域, 分別為N-端的信號肽序列, 中間的多域區(qū)(multi-domain region)和C-端的WAP結(jié)構(gòu)域[7], 根據(jù)多域區(qū)中氨基酸組成的不同又進一步將甲殼動物中的Crustin分為4種類型, 即CrustinⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。其中,Ⅰ型Crustin的多域區(qū)主要由半胱氨酸富集區(qū)(CRR)構(gòu)成[20]; Ⅱ型Crustin的多域區(qū)除了含有CRR還含有一段甘氨酸富集區(qū)(GRR), 根據(jù)GRR長度的不同, 又可進一步將其分為Ⅱa和Ⅱb兩個亞型[21]; Ⅲ型Crustin在信號肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間存在1個脯氨酸(PRR)和精氨酸富集區(qū)(ARR)[22]; Ⅳ型Crustin較為特殊, 含有2個WAP結(jié)構(gòu)域[23]。本研究獲得的脊尾白蝦序列編碼158個氨基酸, 具有Crustins家族的典型結(jié)構(gòu)特征(圖1), N-端為一個含有18個氨基酸的信號肽序列, C-端為含有8個半胱氨酸的WAP結(jié)構(gòu)域, 8個半胱氨酸兩兩之間通過二硫鍵連接, 共同形成一個緊密的“4 DSC”(four-disulfide core)結(jié)構(gòu)。此外在靠近信號肽的一端還含有一段甘氨酸富集區(qū)(GRR), 靠近WAP區(qū)域還含有一段半胱氨酸富集區(qū)(CRR), 符合典型的Ⅱ型Crustin結(jié)構(gòu)特征, 基于以上特征將本研究得到的歸屬為Ⅱ型Crustin。

3.2 EcCrustin1在脊尾白蝦中的表達模式分析

研究發(fā)現(xiàn), Crustin主要在甲殼動物的血淋巴和鰓中表達, 在其他組織中的表達量相對較低, 如在在克氏原鰲蝦()中, Crustin4主要在血淋巴中表達, 金黃色葡萄球菌刺激后其表達量顯著上調(diào)[24]; 在擬穴青蟹中的研究結(jié)果顯示, Crustin ()主要在鰓組織中表達, 副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌和刺激后, 鰓組織中的顯著上調(diào)[25]。在本研究中脊尾白蝦在血淋巴、胃、鰓、腸道、肝胰腺組織中均有表達, 這些組織作為機體抵御病原入侵的第一道防線, 會直接或間接與外部環(huán)境接觸,在上述組織中具有較高的表達, 可能與其免疫功能密切相關(guān)。副溶血弧菌刺激后, 血淋巴中的表達量迅速升高, 并在6 h達到峰值, 這一結(jié)果與南美白對蝦中的研究結(jié)果相一致[26], 說明在脊尾白蝦抵御病原入侵的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要的功能。

3.3 EcCrustin1的功能研究

Crustin結(jié)構(gòu)較為保守, 目前已知的Crustin都包含3個區(qū)域, 即N-端信號肽序列、多域區(qū)和C-端的WAP結(jié)構(gòu)域, 其中WAP結(jié)構(gòu)域在各個物種間高度保守, 這一結(jié)構(gòu)也是Crustin發(fā)揮其生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[27], 序列比對與同源性分析結(jié)果顯示,具有典型的WAP結(jié)構(gòu)域, 推測可能具有廣譜的抗病原菌活性, 基于此本研究構(gòu)建了成熟肽的原核表達載體, 通過條件優(yōu)化成功誘導(dǎo)其表達, western blot結(jié)果顯示表達的蛋白為目的蛋白。但是進一步研究發(fā)現(xiàn)目的蛋白對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌沒有明顯的抑制作用, 這一結(jié)果與最近在凡納濱對蝦中的研究結(jié)果一致[12], 原因是Crustin的抑菌活性或抑制蛋白酶活性受WAP結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸的數(shù)量和排列方式影響[28-30], 在本研究中未檢測到重組表達的蛋白具有抑菌活性, 這可能與其獨特半胱氨酸排列順序有關(guān)。另外, Crustin的抑菌機制是多種多樣的, 可以通過與病原菌直接接觸并將其殺死, 也可以通過改變機體腸道菌群結(jié)構(gòu)來抑制病原微生物活性[12], 因此對于脊尾白蝦的抑菌機制仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從脊尾白蝦中克隆獲得一個Crustin新變體, 命名為, 序列分析顯示目的基因序列具有典型的Ⅱ型Crustin結(jié)構(gòu)特征, 因此將本研究得到的歸屬為Ⅱ型Crustin。主要在血淋巴中表達, 副溶血弧菌誘導(dǎo)實驗結(jié)果顯示參與脊尾白蝦機體的抗細菌免疫過程。利用原核表達成功獲得了重組蛋白, 為進一步研究抗菌機制奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning, expression, and functional analyses ofin

XU Kai1, 2, LIU Xin-wen1, 2, QIN Hao1, 2, ZHANG Zhen-zhen1, 2, YAN Bin-lun1, 2, GAO Huan1, 2, HU Guang-wei1, 2

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Bioresources and Environment/Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology School of Marine Science and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, China; 2. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, China)

A new Crustin was identified from() to reveal the structure and function of the antibacterial peptide Crustin in. The results show that the length ofcDNA was 740 bp, and the open reading fragment was 477 bp, which coded a 158 amino-acid polypeptide.contained a signal peptide at the N-terminus and a WAP domain at the C-terminus. There were GRR and CRR domains between the signal peptide and the WAP, showing the typical characteristics of a type II Crustin.was highly expressed in the hemolymph and was significantly upregulated (<0.05) after a challenge with, indicating thatplays an important role in theinnate immune response. The recombinant protein was obtained by prokaryotic expression, which provides a reference for further study of its antibacterial function and mechanism.

; antimicrobial peptides; Crustin; gene cloning; prokaryotic expression

Jul. 21, 2021

S945.1

A

1000-3096(2022)1-0140-08

10.11759/hykx20210721002

2021-07-21;

2021-09-16

國家自然科學(xué)基金(31900370); 江蘇省自然科學(xué)基金(BK20191007); 連云港市“521高層次人才培養(yǎng)工程”(2021-1021); 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室開放課題(HS2019001); 江蘇省研究生科研創(chuàng)新計劃(KYCX20_2890, KYCX2021-036)

[National Natural Science Foundation of China, No. 31900370; National Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK20191007; Lianyungang 521 Talent Projects, No. 2021-1021; Open Research Fund of Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, No. HS2019001; Postgraduate Research & Practice Innovation Program of Jiangsu Province, Nos. KYCX20_2890, KYCX2021-036]

徐凱(1997—), 男, 江蘇省蘇州人, 碩士研究生, 主要從事海洋水產(chǎn)動物遺傳育種學(xué)研究, 電話: 0518-85895421, E-mail: xukai971214@163.com; 胡廣偉(1988—),通信作者, 女, 遼寧省朝陽人, 講師, 博士, 主要從事海洋水產(chǎn)動物遺傳發(fā)育研究, 電話: 0518- 85895421, E-mail: hgw0127@163.com

(本文編輯: 楊 悅)