路曉琳，郝娜，成艷梅

上皮性卵巢癌是卵巢惡性腫瘤中發(fā)病率最高的一類腫瘤，由于其早期多無明顯癥狀，不易被重視，導致其總體預后較差，5年生存率較低，死亡率占各類婦科腫瘤首位[1]。目前關于卵巢癌的病因和發(fā)病機制仍不明確，有研究認為，雌激素分泌增多對卵巢上皮細胞有刺激作用，可能增加了患卵巢癌的風險[2]。卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)是一種由腦垂體合成并分泌的糖基化蛋白質(zhì)激素，能夠促進卵泡成熟，與黃體素共同作用還能促進雌激素分泌，在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，因此通過測定FSH值，可以間接判斷卵巢的功能狀態(tài)[3-4]。有研究報道，F(xiàn)SH受體在正?；蜓仔越M織的脈管系統(tǒng)中表達較少，但在人類惡性腫瘤的血管內(nèi)皮細胞中呈現(xiàn)高表達，可作為惡性腫瘤診斷和治療的潛在靶標[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH和上皮性卵巢癌的發(fā)生進展密切相關，能夠誘導卵巢癌細胞增殖，抑制癌細胞凋亡，其調(diào)控機制可能與PI3K/AKT途徑有關，除該通路之外，F(xiàn)SH與卵巢癌之間是否還存在其它介導關系還需進一步研究[6-7]。本研究著重分析不同濃度FSH對卵巢癌細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學功能影響，進而更深入地探討FSH能否通過ERK通路對卵巢癌的發(fā)生發(fā)展起到調(diào)控作用。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

SKOV3和OAW28細胞(購自中國科學院細胞庫)；FSH(購自美國Sigma公司)；胎牛血清、Mc-Coys 5A培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基(均購自Gibico公司)；MTT試劑盒(購自上海避碧云天生物技術有限公司)；Transwell小室(購自美國Invitrogen公司)；細胞培養(yǎng)箱、酶標儀(購自Thermo公司)；倒置顯微鏡(購自Nikon公司)；流式細胞儀(購自美國Beckman-Coulter公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SKOV3細胞用10%胎牛血清配置的Mc-Coys 5A培養(yǎng)基；OAW28細胞用10%胎牛血清配置的RPMI1640培養(yǎng)基；兩種細胞均培養(yǎng)于37℃，5% CO2孵育箱中，用80%的細胞密度進行傳代，待細胞長至取對數(shù)生長期后，進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞生長狀態(tài)觀察 分別取SKOV3和OAW28細胞接種于有蓋玻片的培養(yǎng)基中，待細胞貼壁后分別加不同濃度的FSH(0，20，40，80 IU/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在顯微鏡下觀察各組細胞生長狀態(tài)。

1.2.3 MTT觀察SKOV3和OAW28細胞增殖能力 分別取對數(shù)生長期的SKOV3和OAW28細胞，接種于96孔板中，加入含不同濃度FSH的培養(yǎng)液，每組設5個復孔，在37℃ 5% CO2孵育箱分別培養(yǎng)24、48、72 h后，吸出含藥培養(yǎng)基，加滅菌后的MTT液20 μL,繼續(xù)孵育4 h后取出，加入DMSO微微震蕩溶解，用酶標儀在波長570 nm處測其吸光值(A)，并計算增殖指數(shù)=AFSH不同濃度組/A對照組×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測SKOV3和OAW28細胞周期變化 分別取對數(shù)生長期的SKOV3和OAW28細胞，加入含F(xiàn)SH不同濃度的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，經(jīng)胰蛋白酶消化后，3 000 rpm離心5 min，收集全部細胞至1.5 mL離心管，用事先預冷的PBS緩沖液洗滌2次后，加入預冷的75%乙醇，4℃條件下固定5 h，再經(jīng)1 500 rpm離心5 min，收集細胞，用PBS潤洗一次，加入400 μL PI染液，室溫避光孵育30 min，用流式細胞儀進行檢測細胞凋亡和周期變化，每組設3個復孔。

1.2.5 Transwell實驗檢測SKOV3和OAW28細胞侵襲能力 將Transwell放入培養(yǎng)板中，在上室加入Matrigel基質(zhì)膠，37℃ 30 min形成基質(zhì)膜，然后將FSH不同濃度培養(yǎng)的SKOV3和OAW28細胞接種于Transwell上室，在下室加入500 μL 20% FBS細胞培養(yǎng)液，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用棉簽擦拭上層未遷移的細胞，用PBS清洗下層細胞3次，用乙醇固定30 min，適當風干后用0.1%結晶紫染色20 min，PBS清洗，倒置晾干后在光學顯微鏡下隨機選取5個高倍視野進行細胞計數(shù)，數(shù)量越多則侵襲能力越強。

1.2.6 Western blot檢測不同濃度卵泡刺激素對ERK通路蛋白表達的影響 分別取對數(shù)生長期的各組細胞，加入細胞裂解液充分裂解后，在 4℃，12 000 r/min的條件下進行離心取上清液，用BCA試劑盒檢測各個樣品中蛋白的濃度。若蛋白濃度相差過大，需要將樣品的蛋白濃度調(diào)至一致。將調(diào)整后的樣品加入loading buffer，混勻后煮沸10 min，恢復至室溫后離心，配置8%分離膠，在分離膠上面距頂端3 cm處加入濃縮膠，加入蛋白樣品后，80 V濃縮，120 V分離，電泳結束后轉NC膜2 h、脫脂奶粉室溫封閉2 h、PBST洗膜、加入一抗4℃孵育過夜，PBST洗膜三次后加入二抗，室溫孵育2 h，PBST漂洗3次后采用化學發(fā)光法進行顯色，凝膠成像儀觀察拍照，并用Image-J 軟件分析各組蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同濃度卵泡刺激素對SKOV3和OAW28細胞生長狀態(tài)影響

通過倒置顯微鏡觀察，SKOV3和OAW28細胞經(jīng)不同濃度FSH處理后大部分細胞貼壁生長，狀態(tài)良好，只有少數(shù)細胞由棱形皺縮成圓形，呈懸浮狀態(tài)；與FSH空白組相比，加有FSH組的細胞密集度明顯增加，40 IU/L的時候細胞密度最大，見圖1。

圖1 不同F(xiàn)SH濃度對SKOV3和OAW28細胞生長狀態(tài)影響

2.2 不同濃度卵泡刺激素對SKOV3和OAW28細胞增殖能力的影響

MTT細胞增殖實驗表明，與空白組(0 IU/L)相比，不同濃度FSH作用于SKOV3和OAW28細胞24，48，72 h后，其增殖能力明顯增強(P<0.05)，在FSH濃度為40 IU/L作用48 h后，兩種細胞的增殖指數(shù)均達到最大，當濃度達到80 IU/L時，雖然也促進癌細胞增殖，但增殖指數(shù)較40 IU/L略有下降，詳見表1和表2。

表1 不同濃度FSH作用于SKOV3細胞的增殖指數(shù)比較(%)

表2 不同濃度FSH作用于OAW28細胞的增殖指數(shù)比較(%)

2.3 不同濃度卵泡刺激素對SKOV3和OAW28細胞凋亡及周期的影響

流式檢測結果表明，F(xiàn)SH對SKOV3和OAW28細胞的凋亡起到了明顯的抑制作用，且在濃度為40 IU/L作用48 h，凋亡率最小(P<0.05)，詳見下頁表3；不同濃度的FSH對SKOV3和OAW28細胞細胞周期變化也有顯著影響，隨著FSH濃度增大，兩種細胞G0/G1期百分比隨之下降，S期和G2/M期百分比逐漸上升，SKOV3細胞在40 IU/L時有顯著差異，OAW28細胞在20 IU/L時開始有明顯差異，但在40 IU/L時變化最大(P<0.05)，詳見下頁表4。

表3 不同F(xiàn)SH濃度作用下SKOV3和OAW28細胞的凋亡率(%)

表4 不同F(xiàn)SH濃度作用下SKOV3和OAW28細胞周期變化(%)

2.4 不同濃度卵泡刺激素對SKOV3和OAW28細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗表明，與不含F(xiàn)SH的空白組相比，不同濃度FSH均可以促進SKOV3和OAW28細胞侵襲，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，并且在FSH濃度為40 IU/L作用48 h時，兩種細胞的侵襲能力達到最強，當濃度達到80 IU/L時雖然仍有促進作用，但較40 IU/L略有減弱，見下頁圖2和圖3。

圖2 不同濃度卵泡刺激素對SKOV3細胞侵襲能力的影響圖3 不同濃度卵泡刺激素對OAW28細胞侵襲能力的影響

2.5 不同濃度卵泡刺激素對ERK通路蛋白表達的影響

Western blot結果表明，與FSH空白組相比，含有FSH的各組細胞中Ras，Raf蛋白表達水平顯著增加，使得MEK和ERK1/2磷酸化水平被活化，并且表達水平與FSH呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見下頁圖4和圖5。

圖4 不同卵泡刺激素濃度對SKOV3細胞中ERK通路蛋白表達的影響

圖5 不同卵泡刺激素濃度對OAW28細胞中ERK通路蛋白表達的影響

3 討論

由于卵巢癌早期患者缺乏明顯癥狀，診斷時往往已經(jīng)發(fā)展至中晚期，導致錯失最佳治療時間，并且卵巢因其位置深入盆腔，在行根治手術時不易徹底清除，術后復發(fā)率高，嚴重威脅著人類的健康[8]。因此，探究介導卵巢癌發(fā)生發(fā)展的信號通路，闡明其調(diào)控機制，對于臨床治療卵巢癌具有十分重要的意義。有研究報道，由于FSH受體在卵巢腫瘤中過度表達，在近幾年已經(jīng)將FSH作為卵巢癌的成像生物標記物；此外還證實FSH受體參與介導癌癥進展和轉移的信號級聯(lián)反應，靶向FSH受體不僅可以作為卵巢癌，而且還可以作為許多其他人類實體癌的介入探針[9-10]。Liu XM等[11]通過建立FSH作用于HO8910和SKOV3兩種細胞模型，證實FSH 通過促進細胞周期時相變化促進卵巢癌細胞增殖，且當 FSH受體呈陽性時，細胞周期變化更明顯。Yan XN等[12]從分子水平探索了FSH通過PI3K/Akt途徑對上皮性卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)FSH對卵巢癌細胞具有促增殖和抗凋亡的作用，可能是FSH與上皮細胞中的受體結合，激活了PI3K/AKT通路，導致突變型p53發(fā)生同向變化，誘導細胞進入增殖周期，而不能及時凋亡，加快了卵巢癌的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH可以促進卵巢癌SKOV3和OAW28細胞增殖和侵襲，誘導細胞從G1期向S期和G2期發(fā)展，加快了有絲分裂進程，抑制細胞發(fā)生凋亡，從而引起細胞惡性繁殖，對卵巢癌的發(fā)展起到了催化作用，與前期文獻報道結果相吻合。

Ras/Raf/MEK/ERK通路是學術界公認的介導腫瘤增殖、分化和細胞存活的經(jīng)典信號通路，它與PI3K/AKT通路一樣，在腫瘤生物學過程中發(fā)揮重要作用[13]。有研究報道，Raf/MEK/ERK途徑對各種譜系細胞的生長，細胞凋亡的預防，細胞周期阻滯和耐藥性的誘導具有不同的作用，例如Raf/MEK/ERK可能會促進前列腺細胞的細胞周期停滯，這可能受到p53的調(diào)節(jié)，因為p53缺陷的前列腺癌細胞中野生型p53的恢復導致它們對化療藥物的敏感性增強，因此在晚期前列腺癌中，誘導Raf/MEK/ERK表達以促進細胞周期阻滯可能是有利的；而在造血系統(tǒng)癌癥中，抑制Raf/MEK/ERK誘導的增殖和耐藥性可能是有益的[14]。另有研究探索了MEK/ERK通路在肝細胞癌發(fā)生中的重要作用，結果發(fā)現(xiàn)索拉非尼可以降低HepG2 和HCC細胞中MEK和ERK磷酸化水平，減少腫瘤微血管生成，產(chǎn)生完全的腫瘤生長抑制作用[15]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，當肺癌細胞受到外界刺激后，則會導致Ras作用位點發(fā)生突變，持續(xù)處于激活狀態(tài)，活化的Ras不斷招募細胞漿內(nèi)Raf蛋白至細胞膜上，進而誘導MEK和ERK蛋白磷酸化，造成癌細胞不可控制地增殖、惡變，同時細胞凋亡數(shù)量減少，間接加速了癌癥的發(fā)展進程[16]?；谏鲜鑫墨I發(fā)現(xiàn)，Ras/Raf/MEK/ERK途徑確實參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，但在不同癌癥中的作用機制也不盡相同，本研究著重探討了FSH介導Ras/Raf/MEK/ERK途徑對卵巢癌增殖、凋亡的影響，結果表明FSH可以上調(diào)SKOV3和OAW28細胞中Ras，Raf，p-MEK和p-ERK蛋白表達，活化ERK通路，通過促進細胞周期轉變來誘導卵巢癌細胞增殖，抑制卵巢癌細胞凋亡，為后期卵巢癌的臨床治療提供了基礎實驗依據(jù)。

綜上所述，不同濃度的FSH可以促進卵巢癌SKOV3和OAW28細胞增殖，誘導細胞周期從G1期向S期和G2期轉變，抑制細胞凋亡，其調(diào)控機制可能與活化Ras/Raf/MEK/ERK信號通路有關。但本研究還存在一定的局限性，后期可以通過動物實驗觀察體內(nèi)注射FSH對卵巢癌組織的影響，并進一步驗證該調(diào)控機制是否與細胞實驗相一致。