黃寶友 夏哲新 陳子寧 張 成 吳艷陽 倪 靜 奚嘉妮 朱芳芳

鐵是大多數(shù)生物體所需的金屬微量營養(yǎng)素，在細(xì)胞水平上參與能量代謝、線粒體功能和DNA合成等功能。膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(ferroportin1，F(xiàn)PN1)是目前已知的唯一具有由胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)移鐵能力的細(xì)胞膜蛋白，也是唯一的非血紅素鐵輸出蛋白[1]。如果細(xì)胞內(nèi)鐵過多，則會以鐵蛋白的形式儲存，當(dāng)體內(nèi)需要時，通過FPN1將鐵釋放入血并循環(huán)進(jìn)入全身組織細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)鐵也經(jīng)由FPN1通道進(jìn)入血漿。巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞后亦通過FPN1向血漿中釋放鐵，過多的鐵可能造成鐵穩(wěn)態(tài)的失衡從而帶來生物毒性，影響細(xì)胞膜的功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。SLC40A1基因編碼FPN1，位于2q32.2，其編碼的蛋白擁有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，末端定位于細(xì)胞膜內(nèi)，具有2個亞型，分別為FPN1A和FPN1B，前者擁有一個5-鐵反應(yīng)元件，在鐵缺乏細(xì)胞中表達(dá)受到抑制；后者主要表達(dá)于十二指腸細(xì)胞,沒有上述反應(yīng)元件，因此它在鐵缺乏細(xì)胞中也能夠持續(xù)地向細(xì)胞外供鐵[3]。

在多種癌癥研究中發(fā)現(xiàn)，SLC40A1低表達(dá)可以被用作癌癥臨床預(yù)后不良的預(yù)測，且下調(diào)SLC40A1表達(dá)可能通過減少鐵外流促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。值得注意的是，SLC40A1在常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤如宮頸癌(cervical cancer,CESC)、卵巢癌(ovarian cancer,OV)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,UCEC)的表達(dá)譜和預(yù)后潛力仍然未知。因此本研究通過結(jié)合不同的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫探討不同疾病中SLC40A1的表達(dá)及SLC40A1表達(dá)量與臨床預(yù)后的相關(guān)性，以挖掘疾病診斷和預(yù)后指標(biāo)。

材料與方法

1.SLC40A1人體組織分布情況：GeneCard數(shù)據(jù)庫展示SLC40A1在人體主要組織和器官中的分布情況[4]。GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析SLC40A1不同變異體在CESC、OV、UCEC分布情況[5]。

2.SLC40A1mRNA、蛋白表達(dá)情況：Oncomine數(shù)據(jù)庫分析SLC40A1在不同癌癥組織及正常組織中表達(dá)的差異[6]。Timer2.0是一個交互式的在線工具，可利用TCGA數(shù)據(jù)研究SLC40A1在正常組織與癌癥組織中的表達(dá)差異[7]。GEPIA2分析 SLC40A1mRNA在CESC、OV、UCEC和正常組織表達(dá)的差異。HPA數(shù)據(jù)庫展示SLC40A1蛋白在正常組織和腫瘤組織中免疫組化的結(jié)果[8]。

3.SLC40A1表達(dá)量與臨床預(yù)后分析：Ualcan是腫瘤亞組基因分析和生存分析的工具，SLC40A1表達(dá)量與腫瘤不同分期的相關(guān)性[9]。HPA 驗證SLC40A1高低表達(dá)與患者生存率的相關(guān)性。

4.蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析：GeneMANIA數(shù)據(jù)庫生成SLC40A1相互作用網(wǎng)絡(luò)，并評估這些相互作用的作用[10]。STRING數(shù)據(jù)庫生成SLC40A1的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)[11]。取兩者共同的互作基因，利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫研究了不同疾病中SLC40A1mRNA的表達(dá)與互作基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性。

結(jié) 果

1.SLC40A1分布情況：GeneCard展示了SLC40A1廣泛分布人體各個組織，其中肝臟、腎臟、胎盤組織中為主，女性生殖系統(tǒng)表達(dá)量也較高(圖1A)。GEPIA2顯示 SLC40A1 在CESC、OV、UCEC中存在7種變異體，其中以SLC40A1-001最為常見(圖1B)。

圖1 SLC40A1分布情況A.SLC40A1在人體各種組織中的分布，女性生殖系統(tǒng)表達(dá)量較高;B.GEPIA2數(shù)據(jù)庫SLC40A1在CESC、OV、UCEC中的變異體分布情況

2.SLC40A1mRNA表達(dá)情況：Oncomine分析得出SLC40A1在肺癌、前列腺癌、白血病以及卵巢癌中低表達(dá)，而在腦和神經(jīng)腫瘤中高表達(dá)，在CESC、UCEC中尚無研究，OV研究結(jié)果表明，在癌組織中呈低表達(dá)(圖2A)。Timer 2.0數(shù)據(jù)庫中 SLC40A1mRNA在不同類型癌癥中癌組織與正常組織表達(dá)情況，因卵巢癌中無正常組織對照而無法判定差異，在CESC、UCEC較正常組織均呈低表達(dá)且差異顯著(圖2B)。GEPIA2數(shù)據(jù)庫中SLC40A1mRNA在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤較正常組織表達(dá)低，CESC、OV差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而在UCEC中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2C)。圖2中B與C的結(jié)果略有不同，但是趨勢基本上一致，考慮是病例數(shù)不同或數(shù)據(jù)來源不同造成的偏倚。

圖2 SLC40A1 mRNA在組織中的表達(dá)情況A.Oncomine數(shù)據(jù)庫SLC40A1 mRNA在不同類型癌癥中癌組織與正常組織表達(dá)情況；B.Timer 2.0數(shù)據(jù)庫SLC40A1 mRNA在不同類型癌癥中癌組織與正常組織表達(dá)情況，CESC、VCEC差異有統(tǒng)計學(xué)意義；C.GEPIA2數(shù)據(jù)庫SLC40A1 mRNA在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤較正常組織表達(dá)低，CESC、OV差異有統(tǒng)計學(xué)意義。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。TPM.每百萬轉(zhuǎn)錄數(shù)

3.LC40A1蛋白表達(dá)情況：通過HPA數(shù)據(jù)庫將SLC40A1蛋白在CESC、OV、UCEC中的表達(dá)情況，圖3中A～C顯示SLC40A1蛋白在宮頸鱗癌、宮頸腺癌較正常宮頸組織表達(dá)低；圖3中D～F顯示SLC40A1蛋白在漿液性卵巢癌、黏液性卵巢癌較正常卵巢組織的表達(dá)低；圖3中G～H顯示SLC40A1蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌較正常子宮內(nèi)膜組織表達(dá)低，以上均從組織的蛋白層面證明癌組織中低表達(dá)，與SLC40A1 mRNA的表達(dá)趨勢相符合。

圖3 SLC40A1免疫組化結(jié)果A～C.正常宮頸組織、宮頸鱗癌、宮頸腺癌SLC40A1蛋白的表達(dá)情況； D～F.正常卵巢組織、漿液性卵巢癌、黏液性卵巢癌SLC40A1蛋白的表達(dá)情況；G、H.正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜樣腺癌SLC40A1蛋白的表達(dá)情況

4.SLC40A1與腫瘤分期的相關(guān)性分析：Ualcan數(shù)據(jù)庫SLC40A1與腫瘤分期的相關(guān)性分析，在CESC、UCEC中宮頸癌患者較正常人SLC40A1表達(dá)低，且部分呈腫瘤分期越晚，表達(dá)越低。在CESC中，Ⅱ期、Ⅳ期患者較正常人明顯低表達(dá)，Ⅰ期較Ⅱ期明顯低表達(dá)。在UCEC中，Ⅳ期較正常人以及其他期別表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。特殊的是，在OV中不同腫瘤分期間的SLC40A1表達(dá)無明顯趨勢，各組間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測原因是卵巢癌早期患者較少，一般發(fā)現(xiàn)均以晚期為主，需要增加早期卵巢癌患者數(shù)量再進(jìn)一步統(tǒng)計學(xué)分析。

5.SLC40A1與臨床生存率的相關(guān)性分析：HPA數(shù)據(jù)庫SLC40A1與臨床生存率的相關(guān)性分析，291例宮頸癌、541例子宮內(nèi)膜癌中SLC40A1表達(dá)量不同，其5年生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在CESC中，152例高表達(dá)、139例低表達(dá)的5年生存率分別為73%、58%；在UCEC中，210例高表達(dá)、331例低表達(dá)的5年生存率分別為83%、73%。而在OV中SLC40A1表達(dá)量不同，其5年生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，75例高表達(dá)、298例低表達(dá)的5年生存率基本相同。

6.SLC40A1蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析：GeneMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了SLC40A1的蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)，中間的節(jié)點代表SLC40A1，周圍的20個節(jié)點代表與SLC40A1相關(guān)的基因，STRING構(gòu)建10個相關(guān)基因(圖4)。CP、HEPH、HAMP、SLC11A2這4個相關(guān)基因兩者共有，SLC40A1與4個基因在OV中的表達(dá)均顯著相關(guān)。而在CESC、UCEC中，除了與HAMP無顯著相關(guān)性，其余均顯著相關(guān)。

表1 SLC40A1 在婦科惡性腫瘤中的預(yù)后分析

討 論

1. SLC40A1與鐵代謝的關(guān)系：不同條件下鐵在癌細(xì)胞中發(fā)揮著不同的作用。一方面，鐵可以改變作為自由基電子供體的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。過量的自由基會促進(jìn)基因突變，從而加速腫瘤的發(fā)生。另一方面，鐵作為一種營養(yǎng)元素，對癌細(xì)胞的生長和增殖至關(guān)重要[12]。鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)，即過量鐵的獲取和保留，有助于腫瘤的發(fā)生和腫瘤的生長，這一觀察結(jié)果孕育了在抗癌治療中靶向細(xì)胞內(nèi)鐵的各種方法，包括使用鐵螯合劑和針對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1，TFR1)的細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)物，誘導(dǎo)鐵依賴性細(xì)胞死亡的藥物治療癌細(xì)胞是一種將癌細(xì)胞中過量的鐵轉(zhuǎn)化為治療優(yōu)勢的策略[13]。已知參與鐵代謝的基因36個，包括HAMP、CP、HEPH、Tf、TfR1、TfR2、HFE、HJV、STEAP3、MET1(DMT1)、DCytb、ZIP14、ZIP8、SCARA5、FLVCR2、HRG-1、CDP1、CD91、CD163、HO-1、Mfrn1、Mfrn2、ABCB7、ALAS1、FLVCR1、FTMT、FtH、FTL、PCBP1、PCBP2、NCOA4、FPN1、IRP1、IRP2、FBXL5、FAM96A，本研究中互作基因絕大多數(shù)屬于鐵代謝基因，側(cè)面反映了SLC40A1在鐵代謝中的作用[14]。

圖6 SLC40A1蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析A.GeneMANIA構(gòu)建SLC40A1互作蛋白20個；B.STRING構(gòu)建SLC40A1互作蛋白10個；C.CESC中SLC40A1與HEPH、CP、HAMP、SLC11A2互作蛋白表達(dá)的相關(guān)性；D.OV中SLC40A1與HEPH、CP、HAMP、SLC11A2互作蛋白表達(dá)的相關(guān)性；E.UCEC中SLC40A1與HEPH、CP、HAMP、SLC11A2互作蛋白表達(dá)的相關(guān)性。TPM.每百萬轉(zhuǎn)錄數(shù)

目前許多種鐵螯合劑包括Dp44mT、Deferasirox (DFX)和Deferoxamine (DFO)等通常會觸發(fā)各種癌細(xì)胞的凋亡引起細(xì)胞死亡，已被開發(fā)為靶向鐵代謝的抗癌藥物[15]。在實體腫瘤和急性髓細(xì)胞白血病中，鐵螯合劑或以其他方式影響鐵代謝的藥物都可以誘導(dǎo)分化并抑制細(xì)胞增殖[16, 17]。有臨床研究表明，鐵螯合劑在白血病和神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中獲得了抑制腫瘤的潛在獲益[18]。此外，鐵螯合劑可以與分子靶向藥物聯(lián)合用于治療頑固性和耐藥性癌癥。Dp44mT可顯著逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對依托泊苷的耐藥性，并可顯著逆轉(zhuǎn)表皮癌細(xì)胞對長春新堿的耐藥性[19]。另有文獻(xiàn)報道，DFX被用于治療高血清鐵蛋白和妥珠單抗奧唑咪定耐藥性白血病，DFX降低了血清鐵蛋白，消除了持續(xù)輸血的需求，并幫助患者實現(xiàn)完全緩解[20]。

2. SLC40A1與腫瘤預(yù)后的關(guān)系：在臨床預(yù)后的研究中，Wang等[21]研究表明，F(xiàn)PN1在正常肝組織、癌旁組織表達(dá)呈強陽性，而在肝癌細(xì)胞中大部分表達(dá)缺失或降低，且與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、TNM分期晚、門靜脈浸潤、細(xì)胞低分化相關(guān)，認(rèn)為SLC40A1低表達(dá)預(yù)測肝癌預(yù)后不良。Liu等[22]通過生物信息學(xué)分析總結(jié)了肺癌組織中SLC40A1mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，低SLC40A1表達(dá)與肺癌患者預(yù)后較差密切相關(guān)且SLC40A1與鐵穩(wěn)態(tài)和免疫顯著相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，SLC40A1低表達(dá)與乳腺癌患者無轉(zhuǎn)移生存期有關(guān)，與雌激素受體缺失、低分級、淋巴轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后因素相關(guān)，是乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測因子[23]。乳腺癌中SLC40A1表達(dá)下調(diào)，并且這種下調(diào)程度與預(yù)后相關(guān)，在乳腺癌細(xì)胞中恢復(fù)SLC40A1的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的生長，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在三陰乳腺癌中SLC40A1表達(dá)減少也導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生，E-cadherin表達(dá)增加，N-cadherin、Twist和Slug表達(dá)減少[24]。本研究發(fā)現(xiàn)在婦科惡性腫瘤中的結(jié)果與肝癌、肺癌相似，而與乳腺癌相反。

越來越多的研究者開始關(guān)注SLC40A1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，并在多種腫瘤細(xì)胞上開展基礎(chǔ)實驗。有文獻(xiàn)報道，SLC40A1在前列腺癌組織中的表達(dá)量較增生的前列腺組織及正常前列腺組織明顯降低，SLC40A1能夠抑制癌細(xì)胞增殖甚至不同組織病理學(xué)亞型的前列腺癌細(xì)胞激活聚合途徑，以影響SLC40A1介導(dǎo)的鐵損耗，SLC40A1誘導(dǎo)自噬并激活轉(zhuǎn)錄因子p53和KLF6以及它們共同的下游靶細(xì)胞p21，還能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷基因[25, 26]。另外在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的研究中發(fā)現(xiàn)，SLC40A1的異常下調(diào)與MM的預(yù)后不良和破骨細(xì)胞分化有關(guān)，SLC40A1在MM中下調(diào)，同時促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)鐵的積累和活性氧的產(chǎn)生，SLC40A1敲除促進(jìn)MM細(xì)胞的生長和存活，驗證了SLC40A1的預(yù)后價值及其作為MM的新治療靶點的潛在前景[27]?；仡櫦韧墨I(xiàn)，SLC40A1在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的研究甚少，僅在卵巢癌中有研究，在卵巢癌腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cells，TICs)的遺傳模型中也觀察到類似的SLC40A1減少和TFR1增加，最終結(jié)果是細(xì)胞內(nèi)過量鐵的積累和對鐵增殖的依賴增強，如使細(xì)胞內(nèi)鐵的強制減少，可減少TICs的增殖并抑制腫瘤生長和腫瘤細(xì)胞的腹腔內(nèi)擴散[28]，此外，有進(jìn)一步研究表明SLC40A1的表達(dá)與卵巢癌鉑類耐藥呈明顯負(fù)相關(guān)[29]。

綜上所述，SLC40A1在鐵代謝中具有重要的地位，SLC40A1在宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中呈低表達(dá)，宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)量低預(yù)示患者的腫瘤分期越晚，同時生存率越低，是潛在的臨床預(yù)后標(biāo)志物。