陳君平 程蘭蘭 王 健 徐 軍

盡管基于影像學(xué)和病理診斷的TNM分期是目前指導(dǎo)肺癌治療、判斷預(yù)后的主要依據(jù)，但仍不能精確判斷腫瘤的生物學(xué)特性及分子水平變化[1]。同一分期接受相同治療的患者生存?zhèn)€體差異很大，提示存在其他獨(dú)立于傳統(tǒng)TNM分期的影響預(yù)后的因素，探尋這些影響化療及靶向治療療效和預(yù)后的分子標(biāo)志物表達(dá)特征，有助于更好地開展肺癌的個(gè)體化治療。2021年第5版WHO肺腫瘤組織學(xué)分類中新增了IASLC(International Association for the Study of Lung Cancer) 肺腺癌分級(jí)系統(tǒng)，與肺癌手術(shù)切除后較高的復(fù)發(fā)率和較短的無病生存期有關(guān)[2]。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(thyroid transcription factor 1,TTF-1)是診斷肺腺癌最常用的標(biāo)志物之一，同時(shí)也是早期肺癌手術(shù)切除后的預(yù)后指標(biāo)，但對TTF-1與晚期肺癌特別是接受不同治療方案的療效判斷和預(yù)后的關(guān)系研究結(jié)果并不一致[3，4]。本研究探討IASLC分級(jí)和TTF-1蛋白表達(dá)對晚期肺腺癌患者療效和預(yù)后的影響，為臨床選擇個(gè)體化治療方案提供參考。

對象與方法

1.患者與組織樣本：回顧性分析中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院2016年1月～2019年12月連續(xù)收治的563例確診為肺腺癌患者的臨床資料，臨床分期為ⅢB～Ⅳ期，均接受EGFR、ALK、KRAS基因突變檢測，從中選取EGFR敏感突變陽性、ALK和KRAS基因檢測陰性、接受表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)一線治療的患者114例(EGFR 突變組)，EGFR陰性且接受培美曲塞聯(lián)合鉑類藥物一線治療患者119例(EGFR非突變組)。所有入組患者均有完整臨床病理資料，包括年齡、性別、吸煙史等，有足夠的組織活檢標(biāo)本，隨訪資料完整。按照IASLC分級(jí)系統(tǒng)(2021版)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)。本研究通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：202112001)，所有納入患者均簽署知情同意書。

2.基因突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(ARMS法)：人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物公司，所有標(biāo)本均采用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚6～8μm，數(shù)量≥10張，應(yīng)用FFPE樣品DNA分類試劑盒提取DNA，將提取好的DNA稀釋成2ng/μl,按42.3μl稀釋好的DNA模板加入2.7μl Taq酶液混合，分別取5μl加入到預(yù)先分裝好的8聯(lián)管反應(yīng)液中，離心后用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，共15個(gè)循環(huán)；93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，共31個(gè)循環(huán)；后31個(gè)循環(huán)60℃收集FAM和HEX信號(hào)，數(shù)據(jù)分析。

3.免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定：采用免疫組織化學(xué)EliVision二步法。兔抗人TTF-1單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，石蠟切片脫蠟至水，其余均在BenchMark-GX全自動(dòng)免疫組化儀(德國羅氏公司)上進(jìn)行，分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。TTF-1陽性定位于細(xì)胞核，結(jié)果判定參考Zhang 等[5]的方法，以陽性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽性，<5%為陰性。

4.療效評(píng)價(jià)及隨訪預(yù)后分析：分為完全緩解(complete response, CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease, PD)?？陀^緩解率(objective response rate, ORR)=(CR+PR)/全部病例數(shù)×100%，疾病控制率(disease control rate, DCR)=(CR+PR+SD)/全部病例數(shù)×100%。無進(jìn)展生存時(shí)間(progression-free survival, PFS)的定義為患者從接受治療開始至疾病進(jìn)展或疾病尚未進(jìn)展的末次隨訪時(shí)間?？偵鏁r(shí)間(overall survival, OS)的定義為患者從接受治療開始至死亡或2021年12月31日的時(shí)間。隨訪截止日期為2021年12月31日。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗(yàn),計(jì)算患者的PFS和OS，并繪制生存曲線比較生存率。單因素及多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析預(yù)后影響因素，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.TTF-1在肺腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：233例初治ⅢB期或Ⅳ期肺腺癌患者基線特征詳見表1。其中EGFR敏感突變陽性114例，突變類型為19del 53例，L858R 51例，少見敏感突變10例(8%)，包括G719X突變5例，19del和L858R突變3例，L861Q突變1例，L861Q和S768I突變1例。233例患者中TTF-1陽性191例(82%，圖1)，低IASLC組織學(xué)分級(jí)、EGFR敏感突變、不吸煙患者TTF-1的陽性表達(dá)率高于對應(yīng)組。

圖1 TTF-1在晚期肺腺癌中的表達(dá)A.肺腺癌IASLC分級(jí)Ⅱ級(jí)(HE染色,×100)；B.同一例TTF-1陽性(EliVision二步法,×100)；C.肺腺癌IASLC分級(jí)Ⅲ級(jí)(HE染色,×200)；D.同一例TTF-1陰性(EliVision二步法,×200)

表1 TTF-1在肺腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.TTF-1蛋白表達(dá)、IASLC分級(jí)對患者不同治療方案近期療效的影響：EGFR突變組中IASLC分級(jí)Ⅲ級(jí)患者的ORR明顯低于Ⅰ、Ⅱ級(jí)患者(P=0.023)，TTF-1陽性患者ORR高于TTF-1陰性患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075)。EGFR非突變組中IASLC分級(jí)Ⅲ級(jí)患者的ORR亦低于Ⅰ、Ⅱ級(jí)患者(P=0.024，表2)。

表2 晚期肺腺癌患者接受不同治療方案的近期療效(n)

3.TTF-1蛋白表達(dá)和IASLC分級(jí)對患者PFS的影響：COX回歸結(jié)果顯示(表3，圖2)，在EGFR突變組和非突變組中IASLC分級(jí)Ⅲ級(jí)、TTF-1陰性患者PFS均短于相應(yīng)對照組，并且IASLC分級(jí)(P=0.008，HR=1.954,95% CI：1.194～3.200)、突變類型(P=0.003，HR=1.711,95% CI：1.207～2.423)是影響EGFR突變組PFS的獨(dú)立因素； IASLC分級(jí)(P=0.002，HR=1.928,95% CI：1.263～2.944)、TTF-1表達(dá)(P=0.002，HR=2.211,95% CI：1.342～3.641)是影響EGFR非突變組患者PFS的獨(dú)立因素。

圖2 IASLC分級(jí)、TTF-1蛋白表達(dá)與晚期肺腺癌患者PFS的關(guān)系

表3 影響晚期肺腺癌患者PFS的COX單因素回歸分析

4.TTF-1蛋白表達(dá)、IASLC分級(jí)對患者OS的影響：在EGFR突變組、EGFR非突變組中IASLC分級(jí)Ⅲ級(jí)、TTF-1陰性患者OS均短于相應(yīng)對照組(表4，圖3)，并且TTF-1表達(dá)是影響EGFR突變組(P=0.002，HR=3.727, 95% CI：1.654～8.398)和EGFR非突變組(P=0.005，HR=2.042, 95% CI：1.239～3.365)OS的獨(dú)立因素。

表4 影響晚期肺腺癌患者OS的COX單因素回歸分析

圖3 IASLC分級(jí)、TTF-1蛋白表達(dá)與EGFR突變、無突變患者患者OS的關(guān)系

討 論

TTF-1是一種核轉(zhuǎn)錄蛋白，是診斷肺腺癌最常用的標(biāo)志物之一，同時(shí)也是早期肺癌手術(shù)切除后的預(yù)后指標(biāo)[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，晚期肺癌中TTF-1的表達(dá)與患者的化療療效及預(yù)后有關(guān)，但結(jié)果并不一致[4,6～8]。Oktay 等[6]報(bào)道200例肺腺癌患者TTF-1表達(dá)與OS相關(guān)，但該研究入組病例中還包含了25.5%的Ⅰ～ⅢA期患者，部分患者還接受了手術(shù)治療，其TTF-1陽性率為67.5%，明顯低于大部分研究報(bào)道的陽性率(80%～90%)[9～11]?？赡芘c種族差異導(dǎo)致入組病例中EGFR突變陽性例數(shù)太少有關(guān)(僅17例)，因?yàn)楦鶕?jù)以往研究報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，TTF-1陽性與EGFR突變呈正相關(guān)[5,12,13]。

Park等[4]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR陰性肺癌中TTF-1表達(dá)與患者PFS和OS都相關(guān)，但TTF-1陽性和陰性組之間對化療的客觀緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，筆者的研究結(jié)果與之基本一致。但也有研究報(bào)道，培美曲塞聯(lián)合奈達(dá)鉑組 TTF-1陽性患者ORR、DCR 均高于TTF-1陰性患者[14]，Misch 等[15]報(bào)道，晚期小細(xì)胞肺癌TTF-1陽性患者化療反應(yīng)率相比陰性者高，TTF-1表達(dá)可能預(yù)測化療療效，TTF-1與肺癌含鉑化療反應(yīng)率存在聯(lián)系，TTF-1表達(dá)還可以預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的療效[16,17]。Schilsky等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TTF-1陽性和陰性組使用一線培美曲塞基礎(chǔ)方案化療持續(xù)時(shí)間無明顯差異，但該研究只是用化療持續(xù)時(shí)間來評(píng)價(jià)化療效果，并未分析TTF-1表達(dá)與患者PFS的關(guān)系。亦有資料顯示，TTF-1陽性者預(yù)后相對差[18]。上述分歧提示肺腺癌TTF-1陽性患者在不同化療方案中療效及預(yù)后存在差異。本研究探討了TTF-1的表達(dá)與晚期肺腺癌患者一線接受培美曲塞基礎(chǔ)化療的療效和預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，TTF-1與患者中位PFS、OS均與TTF-1表達(dá)相關(guān)，COX回歸分析發(fā)現(xiàn)TTF-1表達(dá)是影響患者OS的獨(dú)立因素，TTF-1表達(dá)缺失提示接受培美曲塞基礎(chǔ)化療的患者預(yù)后不良。

關(guān)于TTF-1對晚期肺癌特別是有EGFR敏感突變并接受EGFR-TKIs治療的預(yù)后影響研究較少。本研究結(jié)果顯示EGFR敏感突變肺腺癌中TTF-1陽性率為88.6%，陰性組TTF-1陽性率為75.6%，TTF-1陽性與EGFR突變呈正相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[5，12，13]，提示TTF-1的表達(dá)可以作為預(yù)測患者EGFR突變狀態(tài)的分子標(biāo)志物，如果TTF-1陰性，取材標(biāo)本有限，則可以考慮優(yōu)先檢測EGFR之外的其他分子靶點(diǎn)。Zhang等[5]研究了中國人群大樣本資料TTF-1的表達(dá)，晚期EGFR突變的肺腺癌中TTF-1的表達(dá)與患者PFS相關(guān)，但未分析TTF-1的表達(dá)與患者接受EGFR-TKIs后OS的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，TTF-1表達(dá)與患者PFS和OS均有關(guān)，在EGFR突變組中TTF-1陽性患者ORR高于TTF-1陰性患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075)，可能與入組患者例數(shù)太少有關(guān)(TTF-1陰性者僅13例)，尚需開展大樣本量前瞻性隨機(jī)研究，以明確TTF-1表達(dá)對EGFR-TKIs的近、遠(yuǎn)期療效預(yù)測價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，無論有無EGFR突變，TTF-1蛋白是預(yù)測晚期肺腺癌患者PFS和OS的有效指標(biāo)，能為臨床醫(yī)生在制定個(gè)性化的治療方案時(shí)提供參考。TTF-1表達(dá)影響患者PFS和OS的具體機(jī)制仍未完全明確，TTF-1 在生理狀態(tài)下參與肺上皮組織發(fā)育及分化的調(diào)控，同時(shí)參與調(diào)控腫瘤分化與抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能。肺癌患者TTF-1陽性提示腫瘤尚存在一定程度的正常分化能力，細(xì)胞分化相對成熟，侵襲力相對弱。肺腺癌中TTF-1表達(dá)與細(xì)胞增殖指數(shù)ki-67呈負(fù)相關(guān)，而ki-67與化療患者ORR呈顯著負(fù)相關(guān)[5, 19]。本研究結(jié)果亦顯示，IASLC組織學(xué)分級(jí)低肺腺癌TTF-1的陽性表達(dá)率高于分級(jí)高者，說明細(xì)胞分化越差，增殖能力越強(qiáng)，TTF-1越容易出現(xiàn)表達(dá)缺失，侵襲能力越強(qiáng)，越能抵抗化療和EGFR-TKIs，患者預(yù)后越差。

2021年第5版WHO胸部腫瘤組織學(xué)分類中新增了IASLC肺腺癌分級(jí)系統(tǒng)，Ⅰ級(jí)以貼壁樣為主，<20%高級(jí)別模式(實(shí)性、微乳頭、纖維間質(zhì)內(nèi)單個(gè)腫瘤細(xì)胞浸潤)；Ⅱ級(jí)以腺泡狀、乳頭狀為主伴<20%高級(jí)別模式；Ⅲ級(jí)為任何組織類型伴≥20%高級(jí)別模式。既往研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌的組織類型如實(shí)性、微乳頭狀生長方式與預(yù)后差有關(guān)，Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同生長模式的EGFR突變的肺腺癌其PFS有差別。Jeon等[2]研究發(fā)現(xiàn)，IASLC分級(jí)與ⅠA期肺腺癌手術(shù)切除的預(yù)后有關(guān)。Yu等[20]報(bào)道高組織學(xué)分級(jí)肺腺癌患者接受化療ORR明顯低于低分級(jí)患者，但研究組選取的是患者的手術(shù)切除樣本，優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確全面評(píng)估癌組織的生長模式，但并不能完全反映患者發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)的組織學(xué)狀態(tài)。筆者采用的大多是患者治療前的肺穿刺樣本，結(jié)果顯示，無論有無EGFR敏感突變，同IASLC分級(jí)為Ⅰ、Ⅱ級(jí)患者比較，IASLC分級(jí)Ⅲ級(jí)患者PFS和OS更短，ORR更低，IASLC分級(jí)是預(yù)測培美曲塞基礎(chǔ)化療和EGFR-TKIs的療效和預(yù)后的簡單有用指標(biāo)。本研究不足之處在于肺腺癌有一定的異質(zhì)性，穿刺標(biāo)本組織量少，評(píng)價(jià)IASLC分級(jí)有一定的局限性。