孟利 杜彩萍

（徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇省腦病生物信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中心，江蘇徐州 221004）

0. 引言

神經(jīng)型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）是一氧化氮合酶家族的成員之一，是一種廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞中的催化酶，是一類結(jié)構(gòu)類似于細(xì)胞色素P450還原酶的同工酶[1]。神經(jīng)型一氧化氮合酶在NO合成過程中起著限速酶的作用。nNOS可以通過催化NO信號(hào)分子的產(chǎn)生進(jìn)而在許多生理、病理過程中發(fā)揮重要作用，nNOS蛋白缺乏或者活性異常會(huì)引起一系列疾病[2-8]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)翻譯后修飾SUMO化可以調(diào)節(jié)nNOS活性，并參與調(diào)節(jié)突觸傳遞[9]。除了SUMO化，磷酸化也是調(diào)節(jié)nNOS活性的主要方式。nNOS的主要結(jié)構(gòu)域包括位于氨基端的PDZ結(jié)構(gòu)域，中間的ARG/HEAM/BH4結(jié)構(gòu)域，鈣調(diào)素結(jié)合（CaM）結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)MN結(jié)構(gòu)域以及位于羧基端的FAD-NAPDH結(jié)構(gòu)域[10]。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，nNOS的CaM結(jié)構(gòu)域可以通過與CaM結(jié)合來調(diào)節(jié)nNOS的活性，影響NO的生成，進(jìn)而影響胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)。nNOS的CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渥陨砉δ艿陌l(fā)揮起著重要的作用[11-14]。為了進(jìn)一步揭示nNOS的CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域的作用，本研究構(gòu)建CaM（nNOS）-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體，并通過改變誘導(dǎo)劑IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）的濃度及誘導(dǎo)的時(shí)間和溫度，來獲得高效表達(dá)的CaM（nNOS）蛋白，為進(jìn)一步探究CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)NOS的功能的影響提供了基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 材料

（1）試劑PCR Master Mix、Wizard Plus SV Minipreps DNA Puri fi cation System、GeneClean、LB瓊脂均購自上海生工生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、EcoRⅠ、T4 DNA ligase購自New England Biolabs公司；LB培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；DL1000、DL2000、DL5000 DNA marker均購自Takara公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Plus Prestained Protein Ladder（26616，26619）購自Thermo公司；抗GST蛋白的抗體購自Millipore公司。測(cè)序委托上海生工生物工程有限公司完成。

（2）細(xì)胞與質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ、BL21購于上海生工生物工程有限公司；nNOS-pME18S質(zhì)粒由本室保存。

1.2 方法

（1）引物設(shè)計(jì)與合成，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

（2）CaM-nNOS重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以nNOS（全長(zhǎng)）-pME18S重組子為模板，PCR擴(kuò)增CaM-nNOS cDNAs（2040bp～2400bp），用1.5%瓊脂糖凝膠純化目的基因。在連接酶的作用下與pGEM-T vector相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ中，于大腸桿菌細(xì)胞中擴(kuò)增。提取質(zhì)粒經(jīng)EcoR I、BamH I酶切，同時(shí)酶切pGEX-4T-1，回收純化，將目的基因亞克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后選取陽性重組子委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

（3）蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將CaM-nNOS重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒至菌液在600nm的OD值約0.6～0.8時(shí)，加入不同濃度誘導(dǎo)劑IPTG，于16℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

（4）免疫印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá)取1ml菌液離心獲取菌體，加入100μl上樣緩沖液1x laemmli Buffer，沸水浴5min變性處理。取20μl樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜（NC）膜上，3% BSA室溫封閉2h～3h，用抗GST抗體（1:5000）孵育過夜，washing buffer（10 mmol/L Tris, 100 mmol/L NaCl, 0.1% Tween-20）洗膜5次，每次3min。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔二抗工作液，室溫孵育50min后，washing buffer洗膜（5min×5次），用超靈敏化學(xué)發(fā)光液顯色，BioChem 化學(xué)發(fā)光儀曝光獲取目的條帶。

2. 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建CaM-nNOS- PGEX-4T-1原核表達(dá)載體

nNOS的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如圖1A所示。為了構(gòu)建CaM-nNOSPGEX-4T-1原核表達(dá)載體，以全長(zhǎng)nNOS-pME18S重組體為模板，加入上、下游引物，PCR擴(kuò)增出目的基因，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定發(fā)現(xiàn)，位于約400bp處有目的條帶（見圖1B），將經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T vector在酶的作用下相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ中，于大腸桿菌細(xì)胞中擴(kuò)增，酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定發(fā)現(xiàn)，載體和目的條帶分子量與預(yù)期一致（見圖1C）。

圖1 CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定。（A）nNOS蛋白的主要結(jié)構(gòu)域示意圖。（B）PCR產(chǎn)物的鑒定。（C）CaM-nNOS-pGEM-T vector經(jīng) EcoR I、BamH I酶切鑒定。（D）1、2, CaM-nNOS-pGEX-4T-1 未經(jīng)酶切 ； 3、4,CaM-nNOS-pGEX-4T-1經(jīng)EcoRI、BamHI酶切鑒定。M, DNA marker。

取測(cè)序正確的質(zhì)粒及pGEX-4T-1原核表達(dá)載體分別采用EcoR I、BamH I酶切，膠回收純化后在連接酶的作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ中，于大腸桿菌細(xì)胞中擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定發(fā)現(xiàn)，載體和目的條帶都清晰（見圖1D），以上結(jié)果表明，CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體成功構(gòu)建。

2.2 CaM-nNOS蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

采用IPTG誘導(dǎo)并檢測(cè)CaM-nNOS蛋白的表達(dá)。將CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，再加入LB培養(yǎng)基擴(kuò)增至菌液在600nm的OD值為0.6～0.8時(shí)，加入不同濃度的IPTG(0.25mmol/L，0.5mmol/L)于16℃誘導(dǎo)20h，采用SDS-PAGE來分離蛋白后，采用抗GST抗體免疫印跡，結(jié)果如圖2所示，與GST空載體組及未誘導(dǎo)組相比，除了GST條帶，誘導(dǎo)劑組出現(xiàn)目的條帶；且0.5mmol/L誘導(dǎo)劑組較0.25mmol/L組表達(dá)水平高，因此，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖2 CaM-nNOS蛋白表達(dá)的鑒定。免疫印跡鑒定在誘導(dǎo)溫度為16℃，IPTG的濃度在0.25 mmol/L，0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為20h，CaM-nNOS蛋白的表達(dá)。

3.討論

前期研究表明，CaM是nNOS的變構(gòu)激活蛋白。在外源刺激引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高時(shí)，可以促進(jìn)鈣調(diào)素蛋白（CaM）與nNOS的鈣調(diào)素蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而引起nNOS的活化而發(fā)揮催化作用[11]。由此可見，CaM對(duì) nNOS蛋白質(zhì)活性及功能發(fā)揮極其重要。

目前，常用的體外蛋白表達(dá)載體主要有真核表達(dá)載體及原核表達(dá)載體。真核細(xì)胞常見表達(dá)載體為：pCDNA3.1載體、pAdTrack載體、pEGFP增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體、pSV2表達(dá)載體、CMV4表達(dá)載體等。而原核表達(dá)載體常用的主要包括pET系列、pGEX系列、pMAL系列等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展來選擇目標(biāo)載體。

為了進(jìn)一步探究nNOS鈣調(diào)素蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體，與真核表達(dá)載體相比，主要優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在：原核細(xì)胞中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)成本低、蛋白量大、所需時(shí)間短、便于操作。pGEX-4T-1載體帶有GST標(biāo)簽，小分子蛋白可以與GST融合表達(dá)，便于后續(xù)蛋白表達(dá)的檢測(cè)。蛋白可以采用GST柱子純化，有利于后續(xù)蛋白互作等試驗(yàn)的開展。但是缺點(diǎn)在于，真核啟動(dòng)子在原核細(xì)胞中作用效率不高，如圖2所示，雖然有表達(dá)，但是豐度不夠。在蛋白分子量大的情況下，與GST融合表達(dá)容易引起蛋白表達(dá)不完整，表達(dá)出GST融合蛋白片段較多，真正的目的蛋白反而較少。本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表達(dá)載體的表達(dá)效率不高，分析可能與這兩個(gè)因素相關(guān)。

4. 結(jié)論

通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建了CaM-nNOS-PGEX-4T-1原核表達(dá)載體，并探索了其誘導(dǎo)表達(dá)條件，這為進(jìn)一步開展nNOS相關(guān)研究提供了一定基礎(chǔ)。