劉哲 唐千 位曉娟 張長青 朱振中

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種好發(fā)于中老年人群的關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為進行性關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬及活動受限[1]。隨著疾病進展，患者晚期關(guān)節(jié)功能嚴重受限，只能接受關(guān)節(jié)置換治療，給個人生活及社會經(jīng)濟都帶來了沉重的負擔(dān)[2]。而隨著人口結(jié)構(gòu)的老齡化，OA發(fā)病率顯著提高。據(jù)統(tǒng)計，在中國40歲以上人群中，OA患者總數(shù)已超過1億人，占比高達46.3%[3-4]。然而，目前臨床上早中期OA的保守治療手段如口服非甾體類抗炎藥和關(guān)節(jié)腔封閉治療（透明質(zhì)酸鈉、糖皮質(zhì)激素、局麻制劑等）雖然可一定程度上緩解疼痛癥狀，但對損傷軟骨的修復(fù)作用欠佳，且無法延緩疾病進展[5]。

近年，血小板衍生物被逐漸應(yīng)用于治療早中期OA并取得了可觀的療效[6]。目前根據(jù)制備工藝，應(yīng)用于OA的血小板衍生物主要有“三代”產(chǎn)品，即富血小板血漿（PRP）、血小板裂解液（PL）及血小板源性外泌體（PL-exo）[7]。PRP是通過對自體外周血進行梯度離心而獲得的濃縮血小板產(chǎn)物，經(jīng)凝血酶或鈣劑的激活，濃縮的血小板可釋放豐富的生物活性因子如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等以修復(fù)損傷軟骨。同時，PRP可通過下調(diào)白細胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α等促炎因子的表達，減輕早中期OA炎性反應(yīng)[8]。目前PRP已廣泛應(yīng)用于OA的臨床治療[9-10]。PL是在PRP基礎(chǔ)之上進一步凍融、裂解、離心后所得的濃縮生長因子產(chǎn)物。由于去除了細胞成分，PL免疫源性進一步降低。而PL-exo則是在活化的PRP和PL基礎(chǔ)上進行超速離心后獲得的含有血小板活性成分的細胞外囊泡，其均質(zhì)性更佳，有效成分得到進一步濃縮[11]。目前PL和PL-exo尚處于基礎(chǔ)研究階段。

1 PRP

PRP的定義最早由Kingsley等于1954年提出[12-13]，并隨著其內(nèi)含生長因子的發(fā)現(xiàn)，于20世紀90年代開始應(yīng)用于頜面外科手術(shù)中組織修復(fù)以及一些慢性創(chuàng)面的治療。其后，PRP逐漸用于治療肌骨運動系統(tǒng)疾病，特別是一些慢性運動損傷及退行性疾病[14]。PRP因被證實可以修復(fù)損傷軟骨，緩解局部炎癥反應(yīng)，近年成為早中期OA治療的主流手段之一[15]。

目前已知PRP中包含1 500多種生物活性物質(zhì)，其中各種生長因子、趨化因子及細胞外基質(zhì)蛋白在OA軟骨修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[8,16]。軟骨組織區(qū)別于其他組織，缺少有效的營養(yǎng)供應(yīng)方式，其損傷后修復(fù)較為困難且緩慢[17]。維持軟骨細胞活性、促進軟骨細胞外基質(zhì)表達及減輕炎癥反應(yīng)對改善OA患者預(yù)后，延緩疾病進展具有重要作用[18]。Dos Santos等[19]的實驗表明，PRP可以促進軟骨細胞增殖，提高軟骨細胞中糖胺聚糖及Ⅱ型膠原的表達。Ragab等[20]則在大鼠OA模型上驗證了PRP可抑制軟骨細胞凋亡信號并下調(diào)脂質(zhì)過氧化物（LPO）及TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達水平。Ihnatouski等[21]通過原子力顯微鏡發(fā)現(xiàn)并證實經(jīng)PRP治療可有效改善兔OA軟骨組織形變。

Migliorini等[22]在薈萃分析中共計納入了30項有關(guān)比較關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射PRP與其他傳統(tǒng)生物制劑對OA治療效果的隨機對照研究，指出在治療后第3、6、12個月，相較于傳統(tǒng)腔內(nèi)注射制劑（透明質(zhì)酸或類固醇激素），PRP可明顯緩解關(guān)節(jié)疼痛并改善運動功能，是更為理想的治療制劑。而Abbas等[23]的薈萃分析進一步統(tǒng)計分析白細胞濃度對于PRP治療OA效果的影響，認為不同白細胞濃度的PRP對于OA的治療效果并無明顯區(qū)別。

雖然PRP對OA有著積極的治療效果，但作為血小板衍生物的“第一代”產(chǎn)品，PRP仍有一定的局限性。PRP本質(zhì)為濃縮的自體血小板，仍保留著較強的免疫原性，所以目前應(yīng)用于臨床治療的PRP大多采用自體回輸?shù)姆绞?，這使得一些本身患有血小板相關(guān)疾病的患者無法使用。OA的治療通常需要多次注射，反復(fù)采血對于患者也是不小的負擔(dān)，同時會增加醫(yī)源性感染的風(fēng)險。此外，由于PRP的有效成分多為蛋白組分，其有效半衰期短且體外易降解，治療的穩(wěn)定性仍有待提高[8]。

2 PL

PL是血小板衍生物的“第二代”產(chǎn)品，作為PRP的進一步加工制品，其很大程度上去除了富有免疫源性的血小板膜成分，同時保留了具有生物活性的生長因子等蛋白組分。因此，PL被認為與PRP具有相似的生物活性，在基礎(chǔ)和臨床研究中均被證實可以有效治療OA[24]。

P?tter等[25]比較PRP與PL在靜態(tài)和機械應(yīng)力下對體外軟骨細胞表型和功能的作用，發(fā)現(xiàn)PRP組與PL組軟骨糖胺聚糖的表達無顯著差異；但在應(yīng)力環(huán)境下，與PRP組相比，PL組軟骨細胞亞硝酸鹽生成顯著減少，而TGF-β1表達則明顯增加，提示PL在體外緩解炎癥反應(yīng)及促軟骨生成方面更具優(yōu)勢。Gilbertie等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PL可抑制滑膜細胞炎癥介質(zhì)分泌并促進透明質(zhì)酸合成；用PL干預(yù)的滑膜細胞條件培養(yǎng)基處理滑膜細胞可促進其細胞外基質(zhì)蛋白的分泌。Yan等[27]在體內(nèi)大鼠OA模型中驗證了PL可通過抑制TNF-α介導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）信號，從而抑制炎癥反應(yīng)。此外，Yan等[28]研究發(fā)現(xiàn)，相比于PRP，PL促干細胞增殖和遷移的作用更為顯著，其分子機制可能與自噬效應(yīng)蛋白（Beclin-1）依賴性的細胞自噬相關(guān)。聯(lián)合PL與臍帶間充質(zhì)干細胞能在OA治療中發(fā)揮協(xié)同作用。

Al-Ajlouni等[29]通過前瞻性的臨床試驗研究PL對早中期OA的治療效果，在治療第32、52周，通過僵硬、疼痛、癥狀、日常生活和運動功能5個評分量表進行評估，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射自體PL可緩解早中期OA患者疼痛癥狀，提高患者生活質(zhì)量，改善疾病預(yù)后，是一種相對有效且安全的治療手段。雖然該試驗樣本量偏小，但卻是第一個在臨床試驗方面評價PL對 OA治療效果的研究。然而，由于目前PL并未廣泛應(yīng)用于OA的臨床治療中，所以尚缺少其與PRP療效對比的研究。雖然異體來源的PL尚未有應(yīng)用于OA治療的報道，但其在角膜病和神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用已進入前臨床實驗階段[30]。

總體而言，相較于PRP，PL的制備工藝顯著降低了自身的免疫原性，為異體應(yīng)用提供了可能性，擴大了其臨床應(yīng)用。此外，PRP對儲存溫度較敏感，生物有效周期短，而PL則可穩(wěn)定地儲存在0℃以下的冷凍環(huán)境中，可多次使用。這一定程度上降低了存儲及維護成本，以及反復(fù)穿刺帶來的風(fēng)險，有效降低了血小板衍生制品在臨床應(yīng)用中的浪費率[31]。相較于第一代的PRP，第二代的PL具有相當甚至更優(yōu)的軟骨修復(fù)作用及更靈活的使用場景，未來有望取代PRP在臨床實踐中成為新一代的關(guān)節(jié)腔注射制劑[24,32]。

3 PL-exo

作為細胞外囊泡的重要組成部分之一，外泌體是一種直徑在30～150 nm的含有多種蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)等生物活性成分的微小囊泡[33]。外泌體是細胞間傳遞生物信息的重要紐帶，在各種生理及病理過程中都發(fā)揮著重要作用。多種細胞來源的外泌體如骨髓、滑膜和脂肪間充質(zhì)干細胞來源外泌體及PL-exo等均已在基礎(chǔ)實驗中被報道能夠有效治療OA[34-35]。有研究對PL進行蛋白質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡為其主要組分，因此推測PLexo可能是PL發(fā)揮生物學(xué)功能的主要途徑[36]。目前報道的PL-exo的獲取來源主要有對PRP進行提取和直接對PL進行進一步的超速離心加工[37]。由于免疫源性的存在以及血細胞的殘留，PRP無法進行多人份的混合（可能會導(dǎo)致凝血），每次只能進行單人份PRP的外泌體提取，獲取量較少且成本較高。而PL由于免疫成分的剔除，可以進行一次性的大量提取，但PL制備過程中需要反復(fù)凍融PL，這使得所獲得的外泌體膜可能會出現(xiàn)破裂。因此，PRP與PL各有優(yōu)勢，標準化的制備工藝仍有待進一步研究[11]。

2014年，Torreggiani等[38]首次成功從人PL中分離純化出外泌體，并對該外泌體組分進行初步分析，發(fā)現(xiàn)PL-exo保留了堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、TGF-β、PDGF-BB等多種組織再生相關(guān)生物因子。相較于PL，PL-exo白蛋白等血清成分被剔除，使得有效成分進一步濃縮，是更為理想的組織修復(fù)制劑。隨后，Liu等[39]在體內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)來源于PRP或激活PRP的PL-exo擁有相似的軟骨保護作用，其潛在分子機制可能與激活Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制軟骨細胞調(diào)亡相關(guān)。Otahal等[40]比較單純PL-exo與超急性期血清來源外泌體對于軟骨細胞的調(diào)控，結(jié)果提示兩者均能促進細胞外基質(zhì)合成代謝，但PL-exo可以顯著降低IL-1等炎性因子的表達水平。

作為血小板衍生物的進一步加工產(chǎn)品，PL-exo具有良好的均質(zhì)性、較低的免疫原性及更為濃縮的生物活性組分。此外，得益于天然的磷脂雙分子層的膜結(jié)構(gòu)，PL-exo能夠更好地進入細胞內(nèi)而發(fā)揮作用。雖然目前尚無有關(guān)PL-exo應(yīng)用于OA的臨床對照研究，但美國梅奧診所的學(xué)者們已成功制備了PL-exo凍干粉，復(fù)溶后仍能保持良好的囊泡結(jié)構(gòu)，并對創(chuàng)面愈合及肌腱具有修復(fù)作用[41-42]。因此，PL-exo有望成為一種批量生產(chǎn)的血小板衍生物產(chǎn)品，可實現(xiàn)標準化生產(chǎn)和異體使用，有著廣闊的臨床前景。

4 展望

血小板衍生物目前在OA治療上已取得了許多突破。無論是最初的PRP還是后來的PL及PLexo都被證實是相對理想的軟骨損傷修復(fù)制劑。但是目前針對血小板衍生物仍缺乏相對統(tǒng)一的制備工藝、準確的行業(yè)規(guī)范及基于此的臨床應(yīng)用指南。同時，目前仍有許多問題如注射后的局部代謝降解、組織在位性及靶向性等亟待解決。此外，血小板衍生物成分復(fù)雜，其治療OA的具體分子機制仍尚未闡明，對相關(guān)機制的探索有助于對其進一步的優(yōu)化提純。相信未來基于血小板衍生物的治療手段將不斷完善，并使越來越多的OA患者受益。