周佳勃，吳 桐，林敬軼，劉 雪，邊小琪，李丹彤，岳順利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省動(dòng)物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種重要的氣體信號(hào)分子能夠參與體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)。自1986年NO被正式發(fā)現(xiàn)以來(lái)，它是目前研究最多的體內(nèi)信號(hào)分子和效應(yīng)分子[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)NO在血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等方面均發(fā)揮著重要的作用[2]。此外，關(guān)于NO對(duì)生殖系統(tǒng)影響的研究也越來(lái)越深入。NO可通過(guò)多種通路來(lái)影響精子的生理功能，參與精子的發(fā)生、成熟、獲能和凋亡等過(guò)程,它在提高精子活力、改善精子質(zhì)量、提高胚胎存活率和促進(jìn)胚胎生長(zhǎng)等方面均發(fā)揮著重要作用。

1 NO的定位和合成

NO是一種自由基，由L-精氨酸通過(guò)一氧化氮合酶(NOS)合成[3]。NO廣泛存在于生物體各個(gè)部位，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞、心室內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、非膽堿能神經(jīng)末梢和血小板等[4]。據(jù)報(bào)道，在舒張血管平滑肌和抑制血小板黏附聚集等方面發(fā)揮著重要作用[5]。此外，NO對(duì)生殖系統(tǒng)也有重要影響。NO參與調(diào)節(jié)胎盤(pán)內(nèi)血管張力和激素分泌、月經(jīng)期間血小板活化、抑制子宮收縮等過(guò)程[6]。此外，NO廣泛存在于睪丸、輸精管、前列腺、陰莖等男性生殖器官中，對(duì)精子的發(fā)生、獲能與受精等一系列生理過(guò)程有重要影響。NO的分解途徑有多種，一種是與O2反應(yīng)形成亞硝酸鹽[7]，一種是與血紅蛋白反應(yīng)形成硝酸鹽而分解[8]。此外，NO與硫醇和其他活性氧(ROS)的快速反應(yīng)也可能是其分解代謝途徑之一[9]。

NO的合成方式分為內(nèi)源性和外源性2種，NOS是內(nèi)源性NO合成中最主要的限速酶，根據(jù)其對(duì)Ca2+和鈣調(diào)素(CAM)的依賴性，將其分為神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)3種[4]。其中，nNOS和eNOS呈Ca2+依賴性，其活性受Ca2+和CAM濃度的調(diào)控，而iNOS活性則不受Ca2+和CAM濃度的影響，呈Ca2+非依賴性。研究發(fā)現(xiàn)，eNOS和nNOS主要分布于精子頭部，而iNOS則定位于精子頂體和尾部[10]。3種類(lèi)型的NOS在精子的多種生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。

2 NO對(duì)精子功能的影響

2.1 NO對(duì)精子發(fā)生的影響精子發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。精原細(xì)胞分化為精子需要多種類(lèi)型細(xì)胞、激素、旁分泌因子和表觀遺傳調(diào)控因子的參與。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中的生精細(xì)胞必須從生精上皮的基底部轉(zhuǎn)移到頂端區(qū)外，期間需要通過(guò)錨定連接、緊密連接和間隙連接等來(lái)協(xié)助生精細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，eNOS和iNOS在此發(fā)揮積極的作用。同時(shí)，這2種NOS可能通過(guò)下游的可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶/cGMP/蛋白激酶G信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)睪丸中緊密連接和黏附連接結(jié)構(gòu)，從而影響精子發(fā)生過(guò)程[11]。此外，過(guò)多的NO可影響生精細(xì)胞的增殖[12]。精索靜脈曲張時(shí)，巨噬細(xì)胞和睪丸細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的NOS，從而使NO大量生成[13]，過(guò)量的NO會(huì)抑制線粒體內(nèi)呼吸鏈酶活性，使生精細(xì)胞數(shù)量減少影響精子發(fā)生過(guò)程[14]。除此之外，高溫也可影響NO的生成，仕志達(dá)等[15]利用陰囊熱應(yīng)激法研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)陰囊熱應(yīng)激后，精液NO濃度增加，精子DNA受到損傷，誘導(dǎo)和加速了生精細(xì)胞和精子的凋亡，影響精子發(fā)生過(guò)程。低濃度NO對(duì)精子生成有促進(jìn)作用。但其對(duì)精子發(fā)生的調(diào)節(jié)通路尚不清楚。

2.2 NO對(duì)精子活力的影響NO 具有雙重性，低濃度NO(硝普鈉(SNP)10-9～10-8mol/L)對(duì)精子的多種生理活動(dòng)均有促進(jìn)作用，而高濃度(SNP>10-5mol/L)則會(huì)損傷精子的功能，抑制一系列精子活動(dòng)[16]。WANG等[17]利用SNP(NO供體)和L-NAME(左旋硝基精氨酸甲酯，一種NOS抑制劑)控制NO濃度來(lái)檢測(cè)精子活力從而證明了這個(gè)觀點(diǎn)。有研究表明，低濃度NO可通過(guò)清除自由基和抑制超氧陰離子(O2-)的產(chǎn)生來(lái)提高精子的活力[18]。而高濃度NO則通過(guò)抑制細(xì)胞呼吸和三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞中ATP的減少，從而使精子活力降低[9]。高濃度NO與超氧化物(O2-)形成過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO-)時(shí)，對(duì)精子損害最嚴(yán)重，ONOO-可通過(guò)抑制線粒體呼吸進(jìn)而影響精子活力[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)，高濃度NO可直接引起蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，通過(guò)可逆的S-亞硝基化或不可逆的酪氨酸硝化影響精子活力[20]。此外，一些影響精子活力藥物就是通過(guò)調(diào)節(jié)NO濃度發(fā)揮作用。BANIHANI等[21]在研究咖啡因?qū)佑绊憰r(shí)發(fā)現(xiàn)，咖啡因能顯著增加肌酸激酶的活性，改變精漿中的NO和游離鈣濃度?？Х纫?qū)θ蹙Y患者有很好的治療效果，可顯著提高精子活力。HEEBA等[22]研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀可通過(guò)降低iNOS、NF-κB和Caspase-3的表達(dá)來(lái)抑制睪丸炎癥和細(xì)胞死亡，進(jìn)而提高患者精子數(shù)量和活力。

2.3 NO對(duì)精子凋亡的影響近年來(lái)研究普遍認(rèn)為NO與精子凋亡有關(guān)。NO是生殖細(xì)胞多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，研究發(fā)現(xiàn)NO的產(chǎn)生是精子凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一部分[23]。通常凋亡信號(hào)通路包括線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路。TRAORE等[24]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as/FasL信號(hào)通路是生殖細(xì)胞主要的凋亡通路。Fas/FasL信號(hào)通路是死亡受體信號(hào)通路之一，F(xiàn)as為死亡受體，其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控路徑為：FasL與Fas結(jié)合導(dǎo)致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體而活化，并引起與之結(jié)合的相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變，使Caspase-8前體集聚、斷裂和激活，產(chǎn)生有活性的Caspase-8，從而激發(fā)一系列下游的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[25]。當(dāng)其受到NO的刺激時(shí)，F(xiàn)asL可以通過(guò)泛素-蛋白酶體信號(hào)通路從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(c-FLIP)降解[26]，此通路可能與精子凋亡相關(guān)。除此之外，精子凋亡還可能與ONOO-對(duì)精子的傷害相關(guān)。NO可能與O2-快速反應(yīng)形成劇毒物質(zhì)ONOO=，ONOO-通過(guò)直接氧化反應(yīng)或與脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)相互作用。這些反應(yīng)會(huì)觸發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，包括引起細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)和氧化性損傷使細(xì)胞壞死或凋亡[25]。ZHANG等[27]在研究陰囊熱應(yīng)激后精液NO濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，陰囊熱應(yīng)激可誘導(dǎo)精子凋亡，與陰囊熱應(yīng)激前相比，精液中NO濃度升高，認(rèn)為NO與精子凋亡相關(guān)，高濃度NO可誘導(dǎo)精子凋亡。

2.4 NO對(duì)精子獲能的影響精子獲能是指精子獲得穿透卵母細(xì)胞透明帶能力的生理過(guò)程，是精子在受精前必須經(jīng)歷的一個(gè)重要階段。精子獲能對(duì)后續(xù)的一系列生理過(guò)程有著重要的影響。其涉及由膽固醇降低引發(fā)的質(zhì)膜變化，也會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)離子濃度和特定酶(例如蛋白激酶A)的活性[28]。STAICU等[29]在研究體外豬精子獲能時(shí)發(fā)現(xiàn)，豬精子NOS分布與調(diào)節(jié)精子獲能的信號(hào)通路有關(guān)。當(dāng)抑制NOS時(shí)，豬精子的3種蛋白激酶A的底物磷酸化水平就會(huì)下降，獲能精子數(shù)量下降。他們還發(fā)現(xiàn)添加NO抑制劑后會(huì)降低精子內(nèi)源鈣離子的濃度，而精子獲能的關(guān)鍵步驟就是調(diào)控內(nèi)源鈣離子濃度。此外，在NO靶向磷酸化研究中發(fā)現(xiàn)，人精子獲能過(guò)程需要不同蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，特別是蛋白質(zhì)的磷酸化，但對(duì)于不同物種來(lái)說(shuō)，其動(dòng)力學(xué)原理不同。一般來(lái)說(shuō)，低濃度NO可以通過(guò)蛋白質(zhì)S-亞硝基化和環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)通路的激活來(lái)調(diào)節(jié)精子獲能[30]。激活cAMP/PKA通路會(huì)導(dǎo)致精子蛋白磷酸化水平的增加，尤其是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)精子獲能[31]。在精子獲能過(guò)程中，磷脂雙向轉(zhuǎn)運(yùn)酶被激活，使精子膜結(jié)構(gòu)改變，磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)暴露于細(xì)胞膜表面，從而影響獲能過(guò)程。精子獲能過(guò)程還受氧化還原調(diào)節(jié)，因此NO就會(huì)參與此過(guò)程[32]。此外，能量是精子獲能和精卵結(jié)合的基本保障，精子線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化可提供精子獲能過(guò)程中所需的能量。楊麥貴等[33]研究發(fā)現(xiàn)，隨著NO濃度持續(xù)升高，精子呼吸鏈活性下降，從而影響精子獲能過(guò)程，這說(shuō)明高濃度NO不利于精子獲能。

2.5 NO對(duì)精子頂體反應(yīng)的影響頂體反應(yīng)是受精的先決條件。在精子獲能后與卵母細(xì)胞結(jié)合過(guò)程中，頂體會(huì)發(fā)生一系列變化。NO作為一種信號(hào)分子，可影響頂體反應(yīng)的過(guò)程。有研究表明，NO釋放的化合物可通過(guò)引起環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)水平的增加和蛋白激酶G的激活而誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的發(fā)生[34]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，NO可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化進(jìn)而影響頂體反應(yīng)，其途徑為NO通過(guò)激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(sGC)的可溶性異構(gòu)體，從而增加cGMP的濃度[35]。過(guò)多的cGMP激活cGMP依賴性蛋白激酶(PKG)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，從而促進(jìn)頂體反應(yīng)的發(fā)生[36]。據(jù)報(bào)道，L-精氨酸能夠通過(guò)NO信號(hào)通路誘導(dǎo)豬精子的頂體反應(yīng)[37]。此外AQUILA等[38]研究發(fā)現(xiàn)，瘦素能誘導(dǎo)產(chǎn)生NO并增加頂體反應(yīng)，再添加L-NAME后，瘦素誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)就會(huì)被抑制，說(shuō)明NO在誘導(dǎo)頂體反應(yīng)中發(fā)揮主要作用，但其具體作用機(jī)制有待研究。此外，精子獲能期間抑制NOS會(huì)減少自發(fā)頂體反應(yīng)的發(fā)生[18]。

2.6 NO對(duì)精子在生殖道運(yùn)輸?shù)挠绊懖溉閯?dòng)物射出精子不能與卵母細(xì)胞結(jié)合，其需要在雌性生殖道中運(yùn)行的過(guò)程獲得受精能力[39]。在生殖道運(yùn)行過(guò)程中，精子會(huì)超激活并最終發(fā)生頂體反應(yīng)，這離不開(kāi)生殖道中NO對(duì)精子的影響。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)生殖道分泌細(xì)胞都具有NOS活性[40]。已在豬的輸卵管、卵巢、卵母細(xì)胞和精子細(xì)胞中檢測(cè)到NO的NOS。研究發(fā)現(xiàn)，豬輸卵管表達(dá)的主要NOS亞型是eNOS[41]，其功能是參與調(diào)節(jié)輸卵管運(yùn)動(dòng)、排卵、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和激活、精子獲能和配子互作[10]。大麻素是一種脂質(zhì)介質(zhì)，參與多種雌性和雄性生殖功能的調(diào)節(jié)。OSYCKA-SALUT等[39]研究發(fā)現(xiàn)，大麻素可能通過(guò)在精子獲能過(guò)程中激活NO通路來(lái)調(diào)節(jié)精子從輸卵管上皮細(xì)胞的釋放過(guò)程。另有研究發(fā)現(xiàn)，在孕酮誘導(dǎo)的精子頂體反應(yīng)過(guò)程中，NO能夠激活環(huán)氧合酶，提高前列腺素E2合成[34]。前列腺素E2能延緩受精卵在輸卵管內(nèi)的運(yùn)行。以上研究表明NO可以影響精子在輸卵管中的運(yùn)輸過(guò)程，進(jìn)而影響精子獲能、頂體反應(yīng)、受精等一系列生理過(guò)程。

2.7 NO對(duì)精子受精的影響精子受精過(guò)程離不開(kāi)NO的參與，而且NO對(duì)精子的體內(nèi)、體外受精均有影響[29]。精子完成受精要經(jīng)歷一系列過(guò)程，包括精子獲能、頂體反應(yīng)等，其均受NO的影響，適宜濃度的NO對(duì)其均有促進(jìn)作用。因此，精子體內(nèi)受精過(guò)程離不開(kāi)NO的參與。NO在體外受精的研究較少，F(xiàn)RANCAVILLA 等[42]認(rèn)為NO對(duì)精子體外受精的作用是間接的，其通過(guò)促進(jìn)決定受精成功的精子功能來(lái)影響受精。STAICU等[29]研究發(fā)現(xiàn)，NO是通過(guò)調(diào)節(jié)精子獲能過(guò)程和促進(jìn)精子與透明帶結(jié)合來(lái)影響體外受精。FRANCAVILLA等[42]還發(fā)現(xiàn)在體外受精前降低NO濃度會(huì)影響精子的體外受精效果。由此推測(cè)，NO參與維持精子的受精能力。此外，NO對(duì)受精過(guò)程中卵母細(xì)胞激活也有影響，有研究發(fā)現(xiàn)NO可通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+依賴的sGC/cGMP通路[7]來(lái)激活卵母細(xì)胞。由此表明，NO在精子體內(nèi)與體外受精中均發(fā)揮著重要的作用。

3 小結(jié)

NO是體內(nèi)重要的氣體信號(hào)分子，參與身體各項(xiàng)生理活動(dòng)，對(duì)生殖系統(tǒng)也有重要的影響，尤其是雄性生殖過(guò)程。NO與NOS參與精子的發(fā)生、獲能、頂體反應(yīng)和凋亡等一系列生理過(guò)程。NO的作用具有雙重性，低濃度可以提高精子活力、促進(jìn)精子獲能過(guò)程，而高濃度則會(huì)抑制。此外，目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)NO促進(jìn)或抑制精子功能的多種調(diào)節(jié)通路，如NO促進(jìn)精子活力的相關(guān)通路和NO調(diào)節(jié)精子凋亡的相關(guān)通路。但有關(guān)NO對(duì)精子頂體反應(yīng)、受精與在生殖道中的運(yùn)輸?shù)挠绊懙木唧w機(jī)制尚不明確還有待深入研究。