徐淑琴 ， 馬祥兆 ， 陳曉慧 ， 賀 曦 ， 賀曉龍 ， 冶貴生

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院 ， 青海 西寧 810016 ; 2.青海省動(dòng)物疾病病原診斷與綠色防控技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 青海 西寧 810016)

藏羊是青藏高原的特色畜種之一，對(duì)惡劣環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，采食粗飼草類后主要通過(guò)瘤胃微生物的復(fù)雜且多方面的協(xié)調(diào)方式進(jìn)行發(fā)酵和降解[1]。而纖維降解菌作為瘤胃微生物中的優(yōu)勢(shì)菌群，主要分泌與纖維降解相關(guān)的酶來(lái)發(fā)揮降解纖維素的作用，進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)飼草的利用率[2]。其中，芽孢桿菌中就可產(chǎn)生內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶、葡萄糖苷酶等纖維素活性酶，這些酶具有穩(wěn)定性好、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)酶活性高等優(yōu)勢(shì)[3]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)早在1989年被美國(guó)食品與藥物管理局批準(zhǔn)使用，隨后在1999年我國(guó)農(nóng)業(yè)部也批準(zhǔn)使用該菌，其是目前公認(rèn)的安全菌株[4]?？莶菅挎邨U菌具有代謝產(chǎn)物種類多、抑菌活性強(qiáng)、抑菌譜廣、能激活免疫、促進(jìn)生長(zhǎng)等功能特性[5]。枯草芽孢桿菌通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)、分泌抗菌物質(zhì)及溶菌作用在生物防治方面發(fā)揮著重要的作用[6]，作為益生菌還具有改善腸道環(huán)境、產(chǎn)生多種消化酶和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提高動(dòng)物免疫力等優(yōu)勢(shì)，因此在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用[7]。研究表明，來(lái)源于動(dòng)物胃腸道的益生菌能夠更好地發(fā)揮菌株在消化道內(nèi)的定植及胃腸道益生功效[8]。因此，本試驗(yàn)利用選擇性培養(yǎng)基從藏羊瘤胃內(nèi)容物中分離篩選出可降解纖維素的芽孢菌株，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為藏羊源益生菌的開(kāi)發(fā)及其在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 樣品及菌株來(lái)源 藏羊瘤胃內(nèi)容物樣品采自青海省海北藏族自治州某養(yǎng)殖場(chǎng)。指示菌株：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌，均為本實(shí)驗(yàn)室自行分離保存菌株。

1.2 主要試劑 纖維素剛果紅培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯、LB肉湯、MH瓊脂、四聯(lián)式牛津杯、革蘭染色液試劑盒、細(xì)菌微量生化鑒定管，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 降解纖維素芽孢桿菌的分離篩選 取新鮮瘤胃內(nèi)容物于胰蛋白胨大豆肉湯過(guò)夜增菌培養(yǎng)。挑取菌液于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)；于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落顏色，選取紅色菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.3.2 分離菌株生化鑒定 根據(jù)分離菌株的菌落和菌體形態(tài)，參照參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、甲基紅(MR)試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)等生化試驗(yàn)。

1.3.3 分離菌株分子生物學(xué)鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株全基因組DNA，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物通過(guò)PCR方法擴(kuò)增分離菌株16S rDNA[10]。30 μL PCR反應(yīng)體系：模板1 μL，2×PCR Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序并將序列通過(guò)BLAST比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.4 分離菌株抑菌試驗(yàn) 將活化好的指示菌稀釋成濃度為108CFU/mL的菌懸液，吸取100 μL均勻涂布于LB瓊脂平板上。將培養(yǎng)24 h的分離菌株12 000 r/ min離心10 min，取上清200 μL注入牛津杯內(nèi)，于4 ℃放置12 h后移至37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.5 分離菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 調(diào)整活化好的菌液細(xì)菌濃度為108CFU/mL，按1%的接種量接種，37 ℃、180 r/min搖床振蕩孵育，每隔2 h取樣1次，測(cè)定0～24 h菌液OD600 nm值，以O(shè)D600 nm值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制分離菌株生長(zhǎng)曲線。

1.3.6 分離菌株藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)分離菌株對(duì)30種常用抗菌藥的敏感性[11]。

1.3.7 分離菌株耐高溫試驗(yàn) 分離菌株按1%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，處理組分別在40、60 ℃和80 ℃水浴30 min，空白對(duì)照組為37 ℃，平板計(jì)數(shù)后按公式(1)計(jì)算菌株存活率。

菌株存活率/%=(處理組活菌數(shù)÷空白對(duì)照組活菌數(shù))×100%

(1)

1.3.8 分離菌株耐酸試驗(yàn) 處理組取分離菌株按1%接種量接種到pH調(diào)整為3.0、4.0、7.0、8.0的LB液體培養(yǎng)基中，空白對(duì)照組為原液，180 r/min 37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在4 h和24 h進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，按照公式(1)計(jì)算菌株存活率。

2 結(jié)果

2.1 降解纖維素芽孢桿菌的分離篩選 菌株在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上菌落呈粉紅色，紋狀皺褶，表面不平整，邊緣不整齊分離(圖1A)；鏡檢結(jié)果顯示，分離菌株革蘭染色呈藍(lán)紫色革蘭陽(yáng)性菌，直桿狀，芽孢近端生，橢圓，孢囊不膨大(圖1B)，將其命名為BS1-ql。

圖1 分離菌株的形態(tài)特性Fig.1 Morphology characteristics of the isolated strainA：菌落形態(tài)； B：菌體形態(tài) (100×)A:Colony morphology; B:Mycelial morphology (100 ×)

2.2 分離菌株生化鑒定 分離菌株BS1-ql能發(fā)酵甘露醇、山梨醇、水楊苷、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖，不能發(fā)酵棉子糖、麥芽糖、松三糖等，不形成吲哚，能水解淀粉、還原硝酸鹽、利用西蒙氏枸櫞酸鹽，不能利用丙酸鹽，在7%氯化鈉、pH 5.7生長(zhǎng)管中可生長(zhǎng)，氧化酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)呈陽(yáng)性，甲基紅反應(yīng)為陰性(表1)，均符合芽孢桿菌的生化鑒定特征。

表1 分離菌株的生化鑒定Table 1 Biochemical identification of the isolated strain

2.3 分離菌株分子生物學(xué)鑒定 通過(guò)PCR從細(xì)菌基因組DNA中擴(kuò)增出目的片段，經(jīng)過(guò)電泳分析PCR產(chǎn)物的大小與預(yù)期一致(圖2)。分離株BS1-ql序列與參考芽孢桿菌16S rDNA序列相似度達(dá)96%以上(圖3)。分離株BS1-ql與枯草芽孢桿菌同源性為100%，并與之聚為一簇(圖4)。結(jié)合生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，綜合判定分離菌株為枯草芽孢桿菌。

圖2 分離菌株的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of the isolated strainM：DL2 000 DNA Marker； 1：分離菌株； N：陰性對(duì)照M:DL2 000 DNA Marker; 1:Isolated strain; N:Negative control

圖3 分離菌株16S rDNA同源性比對(duì)Fig.3 16S rDNA homology comparison of the isolated strain

圖4 分離菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the isolated strain▲:本試驗(yàn)分離菌株▲：Strain isolated in this study

2.4 分離菌株抑菌試驗(yàn) 分離菌株BS1-ql上清液對(duì)沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌分離菌株的抑菌圈直徑分別為8.72、14.50、6.00 mm和27.72 mm，表明枯草芽孢桿菌分離菌株分泌的抗菌物質(zhì)對(duì)這4種致病菌有不同程度的抑制能力，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用最為明顯。

2.5 分離菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 由圖5可知，分離菌株BS1-ql在0～2 h生長(zhǎng)速度較慢，處于延滯期；2 h后生長(zhǎng)迅速，OD600 nm值迅速升高進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；6 h后生長(zhǎng)變緩，逐步進(jìn)入穩(wěn)定期；20 h后分離菌株的生長(zhǎng)量下降，進(jìn)入衰亡期。

2.6 分離菌株藥敏試驗(yàn) 如2表所示，分離菌株BS1-ql對(duì)四環(huán)素和多黏菌素B表現(xiàn)為中度敏感，對(duì)青霉素、頭孢曲松、卡那霉素、多西環(huán)素、呋喃唑酮、新霉素等28種抗菌藥物均表現(xiàn)為敏感。

2.7 分離菌株耐高溫試驗(yàn) 如圖6所示，分離菌株BS1-ql在40 ℃水浴30 min后存活率達(dá)90.32%，隨著水浴溫度的升高，菌株存活率呈直線下降趨勢(shì)，但仍能存活；菌株在60 ℃、80 ℃水浴培養(yǎng)24 h的存活率與水浴30 min的存活率相比，明顯增大，分別為38.75%和58.75%，說(shuō)明分離菌株BS1-ql具備一定的耐高溫能力。

圖6 分離菌株對(duì)不同溫度的耐受性Fig.6 Tolerance of the isolated strain to different temperature

2.8 分離菌株耐酸試驗(yàn) 分離菌株在pH 2.0的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h和24 h后,用平板涂布法檢測(cè)不到存活菌株；在pH 7.0、pH 8.0的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h的存活率分別為1.39%和1.11%，培養(yǎng)24 h后菌株存活率有所升高，分別為7.50%和3.70%。說(shuō)明培養(yǎng)環(huán)境的酸堿性對(duì)分離菌株BS1-ql的生長(zhǎng)有直接影響，pH越小存活率越低，對(duì)堿性環(huán)境有一定的抵抗力。

圖7 分離株對(duì)不同酸度的抗逆性Fig.7 Tolerance of the isolated strain to different acidity

3 討論

青藏高原作為特殊的生態(tài)系統(tǒng)，孕育了性能優(yōu)良的藏羊品種[12]，藏羊在進(jìn)化的過(guò)程中，瘤胃內(nèi)已經(jīng)形成了獨(dú)特的微生物。瘤胃微生物主要由細(xì)菌、原蟲(chóng)、厭氧真菌和少量的噬菌體組成，其中細(xì)菌的種類和數(shù)量最為豐富，根據(jù)功能差異可分為纖維降解菌、蛋白質(zhì)降解菌和脂肪降解菌等，這些菌群在瘤胃中發(fā)揮不同的功能[13]。其中纖維降解菌主要是通過(guò)產(chǎn)生各類酶與纖維素相互作用，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成機(jī)體可分解吸收的分子。本試驗(yàn)選用纖維素剛果紅培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基對(duì)藏羊瘤胃微生物進(jìn)行篩選，得到纖維素降解菌，結(jié)合生化試驗(yàn)和16S rDNA PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定。此方法通過(guò)表型特征與基因鑒定相結(jié)合，操作簡(jiǎn)單便捷，能快速有效地篩選出目標(biāo)細(xì)菌，且能夠準(zhǔn)確鑒定分離菌株的親緣關(guān)系和分類地位。

枯草芽孢桿菌不僅可以產(chǎn)生多種酶提高以粗飼草為主的反芻動(dòng)物的飼料消化率[14]，還可以通過(guò)分泌抑菌物質(zhì)、產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)、競(jìng)爭(zhēng)作用等對(duì)動(dòng)植物致病菌產(chǎn)生明顯的抑制作用[15]。辛國(guó)芹等[16]、Lu等[17]研究表明，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)大腸埃希菌、沙門菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。本試驗(yàn)結(jié)果與已有報(bào)道結(jié)果一致，此外本試驗(yàn)分離的藏羊源枯草芽孢桿菌上清液對(duì)沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制較為顯著。藏羊源枯草芽孢桿菌分離菌株延滯期較短，2～6 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，能夠在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大生長(zhǎng)量，有助于縮短發(fā)酵時(shí)間，可降低生產(chǎn)成本。本試驗(yàn)分離的枯草芽孢桿菌菌株生長(zhǎng)特性與滿麗莉等[18]從中國(guó)豆豉中和袁宗勝等[19]從毛竹體內(nèi)分離篩選出的枯草芽孢桿菌不同，可能是由于菌株來(lái)源不同、存在種內(nèi)差異的原因。本試驗(yàn)分離的菌株對(duì)四環(huán)素和多肽類多黏菌素B表現(xiàn)為中度敏感，且對(duì)β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥等絕大多數(shù)臨床用藥有良好的敏感性，這與杜漢宇等[20]、劉曉燕等[21]的報(bào)道相似，說(shuō)明分離菌株可能不存在耐藥基因，因此在應(yīng)用時(shí)攜帶或轉(zhuǎn)移耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)較低。通過(guò)耐高溫和耐酸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與陳曦等[22]報(bào)道的豬腸源枯草芽孢桿菌的耐高溫結(jié)果相同的是分離菌株隨著水浴溫度的升高，存活率明顯下降，不同的是分離菌株在水浴處理30 min后的存活率較低，而在培養(yǎng)24 h后菌株存活率大幅度上升；與白海等[23]研究報(bào)道的綿羊源枯草芽孢桿菌于pH 2.0處理2.5 h后存活率會(huì)下降至43.9%不同，本試驗(yàn)分離得到的藏羊源枯草芽孢桿菌在酸性環(huán)境下存活率較低，但對(duì)中性偏堿的環(huán)境具有一定的抵抗力；可能是由于菌株來(lái)源不同使得其生物學(xué)特性有所不同，造成了耐受性的差異性。

綜上所述，枯草芽孢桿菌作為高原生境孕育的獨(dú)特的芽孢桿菌資源，具有良好的生物學(xué)特性，有望成為青海藏羊源微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)的潛在候選菌株。