苗玉迪 胡星星 王九菊 李艷春

(1 陜西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，西安，710068； 2 西安大興醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安，710016； 3 西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，西安，710018)

白血病在臨床上較為常見，主要是由于造血干細(xì)胞于不同的階段，出現(xiàn)凋亡受阻、失控性增殖、異常分化等情況，從而導(dǎo)致組織被大量的克隆性白血病細(xì)胞累積、浸潤(rùn)，最終影響正常的造血功能[1]。人急性T淋巴細(xì)胞為白血病最為常見的類型，主要起源于T系細(xì)胞，以惡性增殖為主[2]。對(duì)于此癥，臨床多采用化學(xué)療法、造血干細(xì)胞移植等，但該類治療方法不良反應(yīng)較大，預(yù)后不佳[3]。因此，及時(shí)尋求一種有效、價(jià)格低廉的治療藥物為臨床亟待解決的問題。川楝子為楝科落葉喬木植物川楝的成熟果實(shí)，主要產(chǎn)于貴州、四川等地，味苦、性寒，具有疏肝泄熱、行氣止痛等功效[4]。報(bào)道顯示，該藥可抑制神經(jīng)遞質(zhì)、抗癌、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，多用于治療肝癌、胃癌等疾病中，但關(guān)于川楝子對(duì)白血病的應(yīng)用機(jī)制及效果報(bào)道鮮見[5]?；诖耍疚倪x擇急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)細(xì)胞株及雌性大鼠12只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，展開以下分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 選取2020年1月至2021年12月實(shí)驗(yàn)中心提供的人急性淋巴白血病細(xì)胞T淋巴細(xì)胞(CCRF-CEM)，患者均知情同意，本研究通過陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：2020PS001K)及無(wú)特定病原體Specific Pathogen Free，SPF)動(dòng)物級(jí)6周Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠12只購(gòu)自山東省魯抗醫(yī)藥股份有限公司(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK2013-0001)，體質(zhì)量為(310.00±10.00)g，飼養(yǎng)條件：室溫20～26 ℃，相對(duì)濕度：50%～70%，單籠喂養(yǎng)，喂飼粉狀基礎(chǔ)飼料，自由攝食、飲水，實(shí)驗(yàn)過程遵循3R原則，給予人道主義關(guān)懷。1)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)急性早幼粒細(xì)胞白血病診療指南(2018年版)》符合白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)。2)納入標(biāo)準(zhǔn)：符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；SPF級(jí)6周SD大鼠雌性大鼠；體質(zhì)量≥300 g。3)排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)川楝子等過敏大鼠；合并有嚴(yán)重惡性腫瘤大鼠；合并感染性、血液系統(tǒng)疾病大鼠。4)脫落及剔除標(biāo)準(zhǔn)：中途由于其他因素?zé)o法繼續(xù)參與研究；中途意外死亡大鼠。

1.1.2 藥物 川楝子(上海源葉生物科技有限公司，CAS編號(hào)：79304-40-8)。

1.1.3 試劑與儀器 乙醇(新鄉(xiāng)市先豐醫(yī)藥新材料有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字F20110002)，ECL發(fā)光液(上海士鋒生物科技有限公司，貨號(hào)：R-2374-50 mL)，噻唑藍(lán)試劑(Thiazole Blue，MTT)(上海譜振生物科技有限公司，CAS編號(hào)：298-93-1)；兔抗人單克隆一抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(BCL2-associated X，Bax)(Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab109536)，兔抗人單克隆一抗P53(Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab7015)，兔抗人單克隆一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bax(Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab8926)，P53羊抗兔二抗(Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab9358)，細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0013B)，RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：186025)，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜(Millipore公司，美國(guó)，貨號(hào)：ISEQ00238)，TRIzol、RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN GmbH公司，德國(guó)，貨號(hào)：74106)；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司，貨號(hào)：DRR041A)；粉碎機(jī)(揚(yáng)州諾亞機(jī)械有限公司，型號(hào)：SF50)，圓底燒瓶(泰州市六六順教學(xué)設(shè)備有限公司，規(guī)格：2 000 mL，型號(hào)：GG17)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京金洋萬(wàn)達(dá)科技有限公司，型號(hào)：YRE-2000E)，濾過除菌膜(蘇州優(yōu)可發(fā)新材料科技有限公司，型號(hào)：YKF10018)，二氧化碳(培養(yǎng)箱(南北儀器有限公司，型號(hào)：CHP-80)，Nanodrop 2000儀器(Thermo Fisher公司，美國(guó)，型號(hào)：NanoDrop 2000C)，PCR儀(ABI公司，美國(guó)，型號(hào)：ABI7900)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 培養(yǎng)CCRF-CEM至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為1×108/L，并接種到96孔培養(yǎng)板并分為對(duì)照組、觀察組，于每孔中加入細(xì)胞懸液，容量190 μL，每組取平行孔6個(gè)，于飽和溫度培養(yǎng)箱中、持續(xù)培養(yǎng)24 h。在觀察細(xì)胞中，分別加入質(zhì)量濃度為16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L的川楝子醇提物10 μL；在對(duì)照組中，加三蒸水10 μL，置于與1.2.2條件相同的培養(yǎng)箱中，連續(xù)對(duì)其培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。之后，于每個(gè)平行孔中加入20 μL的MTT，再放入培養(yǎng)箱中，持續(xù)4 h，之后進(jìn)行離心處理，1 000 r/min，離心10 min，離心半徑5.5 cm，棄去上清液，加150 μL的二甲基亞砜，以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值。抑制率為2組吸光度之差與對(duì)照組吸光度的比值[7]。

調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CCRF-CEM細(xì)胞濃度為1×108/L，灌入4個(gè)培養(yǎng)瓶(1瓶對(duì)照組、3瓶觀察組)中，均為9.5 mL，一一標(biāo)記后將其置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)，共24 h，根據(jù)19:1的藥液比，依次加入低、中、高質(zhì)量濃度的川楝子醇提物，均0.5 mL，以使終質(zhì)量濃度分別為16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L，分別設(shè)定為16 mg/L川楝子醇提物組、80 mg/L川楝子醇提物組、400 mg/L川楝子醇提物組。對(duì)照組加入等體積三蒸水，對(duì)其持續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h，收集細(xì)胞并進(jìn)行離心沉淀，之后在沉淀中加裂解液300 μL，進(jìn)行離心處理，持續(xù)10 min后可得蛋白液。進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，再加入兔抗人單克隆一抗Bax、P53、Bcl-2，于4 ℃環(huán)境下孵育過夜，加山羊抗兔二抗，孵育2 h，加ECL發(fā)光液。分析條帶吸光度值。

1.2.2 給藥方法 取川楝子果實(shí)，洗凈、曬干，用粉碎機(jī)打成粉末(約為40目)，以56 ℃的溫度將其烘干，置于圓底燒瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇持續(xù)浸泡24 h，回流提取、過濾，之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓、回收溶劑，最終可得浸膏，使用100 mL乙酸乙酯萃取3次，以同樣方法回收乙酸乙酯萃取劑，真空干燥，得棕褐色固體川楝子醇提物，置于4 ℃的冰箱中保存。取1.02 g川楝素、與6 mL三蒸水溶解，經(jīng)0.22 μm濾過除菌膜進(jìn)行過濾，得170 g/L的川楝子醇提物母液，置于4 ℃的冰箱中保存，以待使用。

于體積分?jǐn)?shù)為10%的新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中、接種CCRF-CEM懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108/L，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(溫度：37 ℃、體積分?jǐn)?shù)：5%)培養(yǎng)，每3天對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行1次更換，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 分析川楝子醇提物對(duì)CCRF-CEM的抑制作用，對(duì)CCRF-CEM凋亡的影響(川楝子醇提物作用CCRF-CEM 24 h、48 h后Bax、P53、Bcl-2基因表達(dá))。使用TRIZOL試劑從1.2.1中的CCRF-CEM中提取總RNA，并使用Nanodrop 2000進(jìn)行定量。使用RNeasy Mini試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Premix Ex TaqTM進(jìn)行RT-qPCR：95 ℃下持續(xù)2 min，58 ℃下維持20 s，然后在72 ℃下反應(yīng)20 s(該步驟40個(gè)循環(huán))，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計(jì)算Bax、P53、Bcl-2的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 川楝子醇提物對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L川楝子醇提物作用CCRF-CEM的不同時(shí)間具有明顯的抗增殖作用。相較于對(duì)照組，于同一時(shí)間點(diǎn)，不同質(zhì)量川楝子醇提物的吸光度值明顯不同，且隨著質(zhì)量的增加，吸光度值逐漸降低(P<0.05)。見表1。

表1 川楝子醇提物對(duì)CCRF-CEM生長(zhǎng)的影響

2.2 川楝子醇提物對(duì)外周血淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組比較，16 mg/L、80 mg/L、400 mg/L川楝子醇提物作用外周血淋巴細(xì)胞同一時(shí)間段的給藥吸光度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示不同質(zhì)量濃度對(duì)外周血淋巴細(xì)胞無(wú)明顯的不良反應(yīng)。見表2。

表2 川楝子醇提物對(duì)外周血淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.3 川楝子醇提物對(duì)CCRF-CEM凋亡的影響 于同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，不同質(zhì)量濃度川楝子醇提物的Bax、P53、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因表達(dá)明顯不同(P<0.05)；Bax隨質(zhì)量濃度的增加而增加，Bcl-2基因表達(dá)隨質(zhì)量濃度的增加而降低，24 h 400 mg/L川楝子醇提物的P53基因表達(dá)達(dá)到最高，而作用于CCRF-CEM 48 h后，基因表達(dá)呈上升趨勢(shì)(P<0.05)。見表3。

表3 分析川楝子醇提物對(duì)CCRF-CEM凋亡的影響

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況 倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組患者的CCRF-CEM分布密度較高，大小一致，多有凸起。見圖1A、圖1B。加藥24 h之后，隨著川楝子濃度的增加，細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的體積減小、生成密度降低、折光性變差等情況。見圖1C、圖1D。加藥48 h后，生長(zhǎng)密度顯著降低，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)碎片。見圖1E、圖1F。

使用Giemsa染色，油鏡下觀察不同濃度川楝子醇提物作用于CCRF-CEM結(jié)構(gòu)變化。對(duì)照組細(xì)胞可見大而圓的細(xì)胞核，胞漿甚少，細(xì)胞膜完整；加藥24 h后，隨著川楝子醇提物作用濃度的不斷增加，作用時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞膜皺縮破損、染色質(zhì)凝聚成塊、核膜破裂。見圖1G、圖1H。

圖1 不同組別細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化情況

3 討論

白血病為一類造血干祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，白血病細(xì)胞大量增殖積累，抑制正常造血，并浸潤(rùn)其他器官組織，患者多見貧血、出血、感染、骨骼疼痛等癥狀，部分患者經(jīng)積極有效的治療后可緩解癥狀，延長(zhǎng)生存時(shí)間，但若病情進(jìn)展迅速，極易導(dǎo)致死亡[8-9]?；瘜W(xué)療法與造血干細(xì)胞移植等方法可在一定程度上緩解患者癥狀，改善病情，但化學(xué)療法無(wú)法徹底殺滅癌細(xì)胞，易擴(kuò)散，且不良反應(yīng)多，異體移植排斥風(fēng)險(xiǎn)較高，治療后復(fù)發(fā)率較高，對(duì)患者帶來(lái)極大痛苦[10-11]。

在中醫(yī)學(xué)中并無(wú)“白血病”稱謂，依據(jù)患者臨床表現(xiàn)、發(fā)病特點(diǎn)，可歸為“虛勞”“熱勞”“瘀積”“濕病”等范疇[12-13]?！妒?jì)總錄》曰：“熱勞之證”，面赤、頭痛、唇焦、食欲無(wú)味，多臥少起，日漸羸瘦者?！鹅`樞》中記載“人之善病腸中積聚者……皮膚薄而不澤”。中醫(yī)治療此病多在扶正固本的治則下徹底消除病灶，清熱解毒，提高患者的抗癌能力，以起標(biāo)本兼治的治療效果。《中華人民共和國(guó)藥典》中收錄的有毒藥物中，抗白血病藥物10余種，有毒中藥川楝子屬于一種植物類，因其味苦，性寒，可歸為理氣類藥物[14-15]。相關(guān)報(bào)道顯示，川楝子的主要成分川楝素，對(duì)于胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)可產(chǎn)生明顯的抑制作用，可見明顯的細(xì)胞凋亡特征，且作用機(jī)制極可能為通過線粒體介導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17]。

本研究結(jié)果表明，不同質(zhì)量川楝子醇提物的吸光度值明顯不同，且隨著質(zhì)量的增加吸光度值逐漸降低。提示川楝子提取物作用CCRF-CEM具有明顯的抗增殖作用，且隨著川楝子質(zhì)量濃度的不斷增加，其對(duì)CCRF-CEM的生長(zhǎng)抑制效果越強(qiáng)，川楝子提取物對(duì)于CCRF-CEM的生長(zhǎng)抑制作用，與其濃度、作用時(shí)間均呈正向關(guān)系[18-19]。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度川楝子提取物的Bax、P53、Bcl-2基因表達(dá)明顯不同；Bax表達(dá)隨質(zhì)量濃度的增加而增加，Bcl-2表達(dá)隨質(zhì)量濃度的增加而降低，24 h 400 mg/L川楝子醇提物的P53基因表達(dá)達(dá)到最高，而作用于CCRF-CEM 48 h后，基因表達(dá)呈上升趨勢(shì)。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況發(fā)現(xiàn)，加藥24 h之后，隨著川楝子濃度的不斷增加，細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的體積減小、生成密度降低、折光性變差等情況；加藥24 h后，隨著川楝子醇提物作用濃度的不斷增加，作用時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞膜皺縮破損、染色質(zhì)凝聚成塊、核膜破裂。分析原因：惡性腫瘤細(xì)胞肆意生長(zhǎng)主要與存在凋亡逃逸現(xiàn)象有關(guān)，若阻斷此現(xiàn)象，需從細(xì)胞凋亡途徑著手，而細(xì)胞凋亡主要包括內(nèi)源性、外源性通路，二者間相互影響，但前者更重要[20-21]。內(nèi)源性途徑中Bax、Bcl-2等促凋亡因子具有十分重要的作用，Bax/Bcl-2比值下降時(shí)，一系列變化可形成“凋亡體”，從而可促使細(xì)胞凋亡。

綜上所述，川楝子醇提物可有效抑制CCRF-CEM增殖，且可通過誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)濃度、時(shí)間依賴性，臨床應(yīng)用價(jià)值顯著，值得推廣。