趙偉芳， 陳夢(mèng)迪， 紀(jì)貝貝， 徐歆歆， 張玉茹， 曹香林， 盧榮華＊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 河南新鄉(xiāng) 453007）

牡丹的根和皮中含有大量芍藥苷（Paeoniflorin，PF）。已有研究證實(shí)PF是一種單萜糖苷[1]，對(duì)全氟辛烷磺酸基化合物損傷的小鼠肝臟有保護(hù)作用[2]，可以減輕四氯化碳（Carbon tetrachloride，CT）誘導(dǎo)的急性肝損傷與慢性肝纖維化[3]，還可以活化巨噬細(xì)胞和緩解二甲基亞硝誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化[4]，對(duì)肝炎[5]、非酒精性脂肪肝[6]和膽汁淤積[7]等也有一定的治療作用。

目前由于環(huán)境污染[8]、配合飼料的配方不完善等原因，養(yǎng)殖魚(yú)類極易出現(xiàn)糖脂代謝紊亂[9]，腹腔脂質(zhì)過(guò)度堆積[10]等問(wèn)題。 PF作為牡丹的有效成分之一[11]，其研究大多在哺乳動(dòng)物上進(jìn)行， 有關(guān)PF對(duì)草魚(yú)糖脂代謝及氧化應(yīng)激方面的相關(guān)研究則非常匱乏。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的PF連續(xù)灌胃草魚(yú)7 d，第7 d注射CT，觀察肝胰臟組織形態(tài)，檢測(cè)血清生化指標(biāo)、 肝胰臟中抗氧化酶活性以及脂質(zhì)代謝相關(guān)因子的變化，分析不同濃度PF對(duì)草魚(yú)血糖、肝胰臟脂質(zhì)代謝和抗氧化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)分為6組，如表1所示，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每日9:00灌胃1次，持續(xù)7 d，末次灌胃3 h后（12:00）進(jìn)行腹腔注射，24 h后取樣。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 實(shí)驗(yàn)魚(yú)及飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)所用草魚(yú)購(gòu)買于安瀛農(nóng)業(yè)有限公司（安康漢濱，陜西），于西北農(nóng)林科技大學(xué)水產(chǎn)示范站的室外培育池進(jìn)行暫養(yǎng)。 暫養(yǎng)4 w后，選取規(guī)格相近的草魚(yú)162尾（92.74 ± 10.02 g），隨機(jī)分入18個(gè)網(wǎng)箱（長(zhǎng)×寬×高=1 m×1 m×1 m）。 實(shí)驗(yàn)期間， 每日正常投喂3次（8:30、11:30 和17:30）商品飼料（粗蛋白含量32%，粗脂肪含量4%，重慶斯特佳生物科技股份有限公司，重慶）。 養(yǎng)殖水溫保持在27～28℃， 其他條件如下：pH7.6 ± 0.2；溶解氧7.0～8.0 mg/L；亞硝酸鹽<0.01 mg/L。

1.3 樣品采集和保存

草魚(yú)經(jīng)MS-222（55 mg/L）麻醉后，使用1 mL注射器抽取尾靜脈血，室溫靜置4 h后，7500 r/min條件下離心10 min，吸取上清分裝至無(wú)菌管中，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；取血后快速分離肝胰臟組織，保存于4 %多聚甲醛溶液中，用于后續(xù)石蠟包埋以及蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin staining, HE染色），另取一些肝胰臟組織經(jīng)液氮速凍后， 于-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)酶活性的檢測(cè)。

1.4 石蠟切片制作及HE染色觀察

使用不同梯度乙醇溶液脫水和二甲苯溶液透明樣品，最后浸蠟包埋；使用切片機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司，中國(guó)）進(jìn)行切片（厚度為6 μm），烘干后使用HE染色試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，北京）對(duì)切片進(jìn)行染色，中性樹(shù)脂封固后自然風(fēng)干，在顯微鏡（卡爾蔡司股份公司，德國(guó)）下進(jìn)行拍照觀察。

1.5 生化及抗氧化指標(biāo)測(cè)定

嚴(yán)格按照試劑盒（南京建成生物工程有限公司，南京）檢測(cè)血清及肝胰臟中葡萄糖（Glucose, Glu）、甘油 三 酯（Triglyceride, TG）、總 膽 固 醇（Total cholesterol, TC）、 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇 （Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、 高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶 （Aspartate aminotransferase, AST）、 過(guò)氧化氫酶（Catalase, CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）的水平。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），鄧肯氏法（Duncan′s）法進(jìn)行多重檢驗(yàn)，用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)P< 0.05 時(shí)，表示各組之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)肝胰臟組織形態(tài)的影響

連續(xù)灌胃PF 7 d后， 草魚(yú)肝胰臟組織形態(tài)如圖1所示。CT組肝胰臟細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，而隨著PF灌胃劑量的增加，低劑量、中劑量和高劑量組的肝胰臟損傷程度得到緩解， 細(xì)胞空泡化程度減輕， 排列逐漸整齊，細(xì)胞核逐漸向中間居中，可見(jiàn)肝胰臟組織修復(fù)情況呈階梯型。

圖1 灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)肝胰臟組織形態(tài)的影響（HE，× 200）

2.2 灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)血清生化和肝胰臟脂質(zhì)水平的影響

草魚(yú)血清生化指標(biāo)和肝胰臟中脂質(zhì)代謝水平的結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。在草魚(yú)血清中，低劑量、中劑量和高劑量組的TG含量與CT 組相比沒(méi)有顯著性差異（P>0.05），低劑量、中劑量和高劑量組的葡萄糖和TC含量顯著低于CT組（P< 0.05），且中劑量組的TC含量顯著低于對(duì)照組（P< 0.05），中劑量組的LDL-C含量顯著低于CT組（P< 0.05），高劑量組的ALT活性顯著低于CT組（P<0.05）；而在肝胰臟中，低劑量和中劑量組的TG含量顯著低于CT組（P< 0.05），且與對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P> 0.05），高劑量組的TC和LDL-C含量顯著低于CT組（P< 0.05），且與陽(yáng)性對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。

表2 灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)血清生化和抗氧化指標(biāo)的影響

圖2 灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)肝胰臟脂質(zhì)水平相關(guān)指標(biāo)的影響

2.3 灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)血清和肝胰臟抗氧化酶活性的影響

灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)血清及肝胰臟抗氧化能力的影響見(jiàn)圖3。 在血清和肝胰臟中，中劑量和高劑量組的SOD活性顯著高于對(duì)照組和CT組（P< 0.05）；血清中高劑量組的CAT活性顯著高于CT組 （P<0.05）；但肝胰臟中，低劑量組、中劑量組和高劑量組中CAT活性與CT組以及對(duì)照組沒(méi)有顯著差異 （P>0.05）。

圖3-1 灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)血清抗氧化酶活性的影響

圖3-2 灌胃不同濃度PF對(duì)草魚(yú)肝胰臟抗氧化酶活性的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)， 給予肝損傷的小鼠PF后其肝組織受損程度緩解，肝臟病理學(xué)特征減輕，炎癥反應(yīng)減輕[3]。PF還可以減少2型糖尿病模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡[12]，而腹腔注射30 mg/kg PF可以緩解脂多糖導(dǎo)致的乳腺組織病理變化[13]。 本研究也發(fā)現(xiàn)灌胃不同濃度PF后，草魚(yú)肝胰臟組織的空泡化和核偏移現(xiàn)象得到一定的緩解，這與中劑量組PF灌胃后草魚(yú)肝胰臟組織中TC、TG和LDL-C的水平均顯著降低等結(jié)果相吻合。 研究還發(fā)現(xiàn)灌胃低、 中和高劑量組濃度的PF可以降低血糖和血清中的TC含量， 這和李珊珊等在小鼠中的研究[12]相吻合。 以上結(jié)果表明，灌胃PF可以降低草魚(yú)的血糖和TC含量，緩解CT誘導(dǎo)草魚(yú)肝胰臟的脂質(zhì)蓄積和代謝紊亂。

CAT和SOD是反映抗氧化能力的典型酶[14]。 有研究證明，比起腎和腦等組織，肝胰臟組織中表現(xiàn)出最高的SOD活性[15]。 本研究結(jié)果顯示，中劑量和高劑量組草魚(yú)血清和肝胰臟組織中的SOD活性均顯著高于CT組， 在小鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)灌胃PF后其血清中SOD活性也顯著升高[12]，說(shuō)明灌胃PF可以提高魚(yú)類的抗氧化能力。

4 結(jié)論

綜上所述， 灌胃100 mg/kg PF對(duì)CT引起的草魚(yú)糖脂代謝紊亂和肝胰臟損傷有一定程度的緩解作用， 這可能和其改善草魚(yú)的糖脂代謝及提高抗氧化酶活性有關(guān)。