姬新穎，馮啟科，劉志月，劉 凱，張俊佩，王紅霞

（1.中國林業(yè)科學研究院 林業(yè)研究所/ 國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091；2.河北農(nóng)業(yè)大學 山區(qū)研究所/河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)技術創(chuàng)新中心/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，河北 保定071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學 園藝學院,河北 保定 071000）

核桃樹體高大，在我國分布范圍廣，由于存在生物逆境、非生物逆境（特別是倒春寒和晚霜），嚴重限制了核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［1］。泛素化修飾在植物響應低溫脅迫、干旱脅迫和光脅迫等非生物脅迫的過程中具有重要作用，主要由E1( 泛素激活酶)、E2 (泛素結(jié)合酶)、E3(泛素連接酶)完成［2-4］。U-box 型蛋白屬于E3 連接酶，因其含有U-box保守結(jié)構域而得名，自1995 年從酵母蛋白UFD2中首次鑒定出具有70 多個氨基酸組成的U-box 蛋白［5］，陸續(xù)又在擬南芥、水稻、香蕉、番茄、柑橘［6-10］等植物中鑒定了U-box 基因家族。Cho 等研究指出擬南芥PUB22和PUB23在干旱脅迫下能夠泛素化RPN12a 來改善植株抗旱能力［11］；Wang等研究揭示了PUB25和PUB26在冷誘導下泛素化MYB15，在擬南芥低響應低溫脅迫中具有精確調(diào)節(jié)作用［12］；Bergler 等研究指出PUB18/PUB19在ABA 誘導或鹽脅迫中可能作為調(diào)節(jié)成分協(xié)同作用［13］；Li 等研究指出PUB12/PUB13負調(diào)控植物體內(nèi)的SA 積累、正調(diào)控JA/ET 信號傳遞進而調(diào)控植物抗性［14］。除了模式植物擬南芥，在水稻、蘋果、苜蓿、大豆等植物中也發(fā)現(xiàn)了與抗性相關的U-box泛素連接酶。Min 等研究表明水稻U-box 型E3 泛素連接酶OsPUB24 通過OsBZR1 的26S 蛋白酶體依賴性降解在BR 信號通路中起負調(diào)節(jié)作用［15］；Byun等研究證實2 種同源水稻U-box E3 連接酶OsPUB2和OsPUB3 是對冷應激反應的正調(diào)節(jié)因子［16］；Han 等 表 明 蘋 果（Malus×domesticaBorkh.） 中MdPUB29可能正調(diào)控耐鹽性［17］；前人研究表明U-box 基因家族在響應冷脅迫過程中起到重要作用，而有關核桃中U-box 基因家族的鑒定和分析尚未見報道。本研究通過生物信息學在核桃基因組中挖掘JrPUBs(U-box)家族成員，并對該家族成員結(jié)構進行分析，結(jié)合低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對該家族差異表達基因在不同組織中的表達特異性以及對低溫脅迫和激素的響應，解析核桃JrPUBs基因家族的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料為盆栽的2 年生嫁接苗[嫁接‘遼寧8 號’（耐冷）和‘清香’（不耐冷）]，本砧，盆栽。采樣及測序參照劉凱［18-19］方法。測序數(shù)據(jù)已上傳至國家基因組科學數(shù)據(jù)中心（https://bigd.big.ac.cn/?lang=zh），項目 ID 為PRJCA006073，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析對家族成員進行鑒定。

1.2 核桃JrPUBs 基因家族分析

核桃JrPUBs家族成員鑒定參照代文強和李津津等［20-21］方法。核桃JrPUBs 家族基因的基因結(jié)構和保守基序使用在線分析工具Gene Structure Display Server 和MEME（http://meme-suite.org/）進行分析。JrPUBs 和AtPUBs 家族系統(tǒng)發(fā)育樹的構建使用利用MEGA7.0 軟件，采用生物進化距離法（Neighbour-Joining, NJ）進行構建，Bootstrap 值為1 000。

1.3 核桃JrPUBs 基因的生物信息學分析

分別利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffnder/查找開放閱讀框，利用https://web.expasy.org/ protparam/查找蛋白質(zhì)的分子量、疏水性和穩(wěn)定系數(shù)，利 用NetPhos 3.1 Server 和Net NGlyc 1.0 Server 進行糖基化和磷酸化位點的預測，利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 進行信號肽預測，利用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/進行跨膜區(qū)預測，利用Plantcare 在線工具查找啟動子序列功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃基因組JrPUBs 家族成員鑒定

構建PUB基因的隱馬爾科夫模型，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序，從核桃全基因組序列中鑒定出85 個核桃PUBs家族基因。利用Pfam 進行結(jié)構域分析，去除冗余后最終得到55 個核桃PUB基因（表1），編碼55 條蛋白質(zhì)序列。由表2 可知，JrPUB 蛋白的長度在169（JrPUB42）～1 505 AA（JrPUB33）之間；等電點在5.08 ～9.03 之間，有62% 核桃JrPUBs家族成員為偏酸性蛋白。JrPUBs基因長度在555（JrPUB8）～10 277 bp（JrPUB49）范圍內(nèi)；開放閱讀框長度在510（JrPUB42）～4 518 bp（JrPUB33）范圍內(nèi)；外顯子除JrPUB49和JrPUB16以外在1 ～8個之間，43%的JrPUBs只含有1 個外顯子，內(nèi)含子除JrPUB49和JrPUB16以外在0 ～7 個之間。

表1 核桃JrPUBs 家族成員的基因信息Table 1 Basic information of JrPUBs family genes in walnut

續(xù)表：

由表2 可知，JrPUBs 分子量最大為167.90（JrPUB33）kD， 最 小 為21.08（JrPUB8）kD；JrPUBs 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)在34.64（JrPUB30）～58.51（JrPUB6）之間，不穩(wěn)定蛋白占82%，穩(wěn)定蛋白僅為18%；從JrPUBs 蛋白的平均疏水性預測數(shù)據(jù)來看，親水蛋白占75%，疏水蛋白僅占25%；蛋白質(zhì)的信號肽和跨膜結(jié)構預測結(jié)果顯示：核桃JrPUBs 家族中53 個成員無跨膜結(jié)構和，僅有2 個成員（JrPUB4 和JrPUB13）有跨膜結(jié)構，2 個成員（JrPUB1 和JrPUB40）有信號肽分泌蛋白；僅有JrPUB44 蛋白定位于細胞核和細胞質(zhì)，其他均位于細胞核。分析核桃JrPUBs 家族成員在蛋白翻譯后修飾的差異有助于后續(xù)對蛋白功能的研究。

表2 核桃JrPUBs 家族蛋白的理化性質(zhì)Table 2 Basic information of JrPUBs family proteins in walnut

續(xù)表：

2.2 核桃基因組JrPUBs 家族系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA7.0軟件將本研究篩選出的核桃（55個）與擬南芥（61 個）PUBs 蛋白序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核桃與擬南芥PUBs 家族基因有一定的同源性，將核桃55 個家族成員分為2 類，一類是與擬南芥Class2 聚到一起的30 個蛋白，另一類是與擬南芥Class3 聚到一起的25 個蛋白，表明核桃JrPUBs 與擬南芥相似成員具有不同生物學功能。

圖1 核桃和擬南芥PUBs 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of JrPUBs family genes of Juglans regia and Arabidopsis thaliana

2.3 核桃基因組JrPUBs 家族蛋白域保守基序與基因結(jié)構

由圖2 可知，分析其保守基序分布，數(shù)量最多的亞組為第10 組，含有13 個成員；最少的為第5組，僅含有1 個成員JrPUB27。不同亞家族內(nèi)具有極高相似度的保守基序，而且不同亞家族中分別含有自己特有的保守基序。通過基因結(jié)構分析可以看出（圖3），核桃基因組JrPUBs家族成員均包含內(nèi)含子，數(shù)量1 ～17 個不等，相同亞組中的基因具有相似的基因結(jié)構。

圖2 核桃JrPUBs 家族蛋白保守基序分析Fig. 2 Conserved motif analysis of JrPUBs family from Juglans regia

圖3 核桃JrPUBs 家族基因結(jié)構分析Fig. 3 Gene structure analysis of JrPUBs family from Juglans regia

2.4 核桃PUBs 家族基因啟動子元件分析

由圖4 可知，核桃PUBs家族基因啟動子區(qū)分布著大量的激素信號和脅迫反應元件，可能與核桃響應非生物脅迫相關。

圖4 核桃JrPUBs 啟動子區(qū)與抗逆和激素相關元件分布Fig.4 Stress and hormone related cis-elements in the promoter region of JrPUBs genes

2.5 核桃PUB 家族成員的表達分析

以 FPKM 為轉(zhuǎn)錄水平描述標準，以padj＜0.05 and log2(FC) ＞1 為差異表達基因篩選標準， ‘遼寧 8 號’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫）在冷脅迫48h 后共獲得了15 個差異表達基因，分別 是JrPUB3、JrPUB7、JrPUB9、JrPUB12、JrPUB17、JrPUB18、JrPUB20、JrPUB21、JrPUB23、JrPUB26、JrPUB32、JrPUB35、JrPUB40、JrPUB42、JrPUB48。由圖5 可以看出，該家族15 個成員在冷脅迫下轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生了不同程度的變化，推測該15 個基因可能會參與核桃響應冷脅迫的過程。對該15 個差異表達基因進行不同組織轉(zhuǎn)錄水平分析，發(fā)現(xiàn)該15 個差異表達基因存在特異性轉(zhuǎn)錄表達，JrPUB7、JrPUB9、JrPUB17、JrPUB18、JrPUB20、JrPUB21在根中轉(zhuǎn)錄水平較高；JrPUB42和JrPUB48在老葉中轉(zhuǎn)錄水平較高；JrPUB3、JrPUB9和JrPUB12在老葉中轉(zhuǎn)錄水平較低；JrPUB42在嫩莖和雄花中轉(zhuǎn)錄水平較低。以上說明該家族15 個成員可能響應冷脅迫并參與植物器官發(fā)育。

圖5 冷脅迫48 h 后‘遼寧8 號’與‘清香’DEGs 轉(zhuǎn)錄表達分析Fig.5 Transcriptional analysis of DEGs in ‘Liaoning NO.8’ and ‘Qingxiang’ under chilling stress for 48 h

3 討論與結(jié)論

隨著全基因組的測序，多個植物中u-box 家族已經(jīng)被鑒定，如雷蒙德氏棉93 個［5］，擬南芥64 個［6］，番茄56 個［9］，柑橘56 個［10］等。Xu 等利用M.truncatula幼苗在3 種不同非生物脅迫下的RNA-seq 數(shù)據(jù)，鑒定出33 個脅迫誘導植物U-box 基因(MtPUBs)，包括到25 個NaCl、15 個干旱和16 個冷調(diào)控的MtPUB［22］。本研究鑒定出55 個核桃PUBs家族基因，并對結(jié)構進行分析，增加了植物PUBs家族的種類，也為進一步研究核桃PUBs基因提供了理論依據(jù)。此外，不同植物間PUBs基因數(shù)目的差異可能與物種有關，也可能與全基因組復制次數(shù)不同有關［23］。

圖6 PUB 家族差異表達基因在不同組織中的表達分析Fig. 6 Expression analysis of PUB family genes in different tissues

本研究對核桃與擬南芥JrPUBs家族基因進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，核桃 U-box 與擬南芥具有相同結(jié)構域的成員聚在一起，全部聚類到擬南芥2 和3 亞族，表明核桃JrPUBs與擬南芥相似成員具有不同生物學功能。進行啟動子功能預測發(fā)現(xiàn)核桃PUBs基因啟動子區(qū)存在豐富的激素信號和脅迫應答調(diào)控元件，核桃U-box 基因啟動子區(qū)至少含一個植物激素響應元件。前人研究表明擬南芥中的AtPUB19對ABA和干旱反應有負調(diào)控作用［24］，Kong L 等研究表明AtPUB12和AtPUB13正向調(diào)控ABA 信號途徑［25］，但AtPUB9 與ABI3 互作，負向調(diào)控ABA 信號通路［26］；這些研究與本研究的預測一致，進一步證明了U-box 可能參與核桃響應非生物脅迫和生物脅迫。

通過冷脅迫轉(zhuǎn)錄表達分析共獲得了15 個差異表達PUB基因，在冷脅迫下轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生了不同程度的變化，推測該15 個基因可能會參與核桃響應冷脅迫的過程。對該15 個差異表達基因進行不同組織轉(zhuǎn)錄水平分析，發(fā)現(xiàn)該15 個差異表達基因存在特異性轉(zhuǎn)錄表達，在不同的組織和不同的處理下存在表達差異。說明該家族15 個成員可能響應冷脅迫并參與植物器官發(fā)育。這些研究將為我們解析核桃U-box基因功能驗證奠定基礎，但具體作用機制有待進一步研究。