杜 鑫

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，四川 南充 637000)

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來的一類高效、廣譜殺蟲劑，通過抑制昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿酶和羧酸酯酶活性，使得昆蟲神經(jīng)功能紊亂而死，具有殘留期短、易代謝、低毒效和擇性強等特點，主要應(yīng)用于果樹、蔬菜及糧食等農(nóng)作物的蟲害防治[1-2]。目前，這類農(nóng)藥的儀器檢測方法主要有氣相色譜法[3-4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜-紫外光度法[7]、液相色譜-柱后衍生熒光法[8-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]。由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有熱不穩(wěn)定性，氣相色譜法受到一定限制。液相色譜-紫外光度法檢測氨基甲酸酯類農(nóng)藥偏少，選擇性較差，靈敏度低、較易出現(xiàn)假陽性。質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分農(nóng)藥的高通量、高靈敏度定性及定量分析，已成為農(nóng)藥多殘留檢測的主導(dǎo)技術(shù)和未來發(fā)展的趨勢[14-16]，但因其價格昂貴、操作復(fù)雜、尚不便于基層檢測實驗室應(yīng)用普及。本研究基于液相色譜-柱后衍生熒光檢測系統(tǒng)，建立了檢測柑橘中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析方法，優(yōu)化了系統(tǒng)檢測條件，極大地提高了分析方法的效率、選擇性和靈敏度，以期為基層檢測機構(gòu)提供技術(shù)參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 試劑耗材 涕滅威亞砜、涕滅威砜、涕滅威、滅多威、三羥基克百威、克百威、甲萘威、異丙威均購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)，濃度均為1 000mg/L，用純甲醇稀釋配制成濃度均為100.0mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，避光保存于4℃冰箱內(nèi)。柱后衍生試劑為水分解堿液為0.05mol/L NaOH溶液(cat.No CB130)，OPA稀釋劑(cat.No CB910)，鄰苯二甲醛(O-Phthaladehyde，OPA，cat.NO 0120)，巰基乙醇(Thiofluor，cat. NO 3700-2000)，均購于美國Pickering公司。

固相萃取小柱(Agilent，SPE-NH2小柱 500mg/6mL，貨號5982-1865)，“CNW”陶瓷均質(zhì)子(貨號CA8A50)和固相萃取裝置(Agilent)；甲醇，乙腈，二氯甲烷等均為色譜級；NaCl為分析純試劑。50mL離心管，PTFE 0.22μm針筒式微孔濾膜。

1.2 儀器設(shè)備 Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀(配有Waters Reagent Manager柱后衍生反應(yīng)裝置)，2475型熒光檢測器，ML802型分析天平，GD16plus高速研磨均質(zhì)儀，3-18KS型高速冷凍離心機，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，VORTEX 3型旋渦混合器，HR386破壁機。

1.3 樣品制備 取有代表性的柑橘(愛媛、春見、檸檬等)全果樣品帶皮切碎，采用四分法縮分后約1kg，放入破壁機中，高轉(zhuǎn)速(30 000 r /min)勻漿均質(zhì)后裝入潔凈的聚乙烯塑料樣品盒中，密封后于-18 ℃冰箱保存(使用前先解凍至室溫)。

1.4 樣品提取 稱取10g(精確至0.01g)柑橘樣品于50mL塑料離心管底部，依次加入1顆陶瓷均質(zhì)子，10.00mL乙腈，5 ～ 7g 氯化鈉，擰緊離心管蓋，放入低溫(5℃)高速研磨均質(zhì)儀中3 000r/min均質(zhì)提取3min，然后5 000r/min離心3min。吸取上清液5.00mL至250mL錐形瓶中，40℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，加入4mL甲醇+二氯甲烷(5：95，V：V)溶解殘余物，渦旋混勻后待凈化。

1.5 樣品凈化 將固相萃取氨基小柱(SPE-NH2)用4mL甲醇-二氯甲烷溶液(5：95，V：V)預(yù)淋洗，當(dāng)液面到達(dá)柱篩板頂部時，立即加入上述待凈化溶液，用50mL茄形瓶收集洗脫液，用3mL甲醇+二氯甲烷(5：95，V：V)涮洗錐形瓶后過柱，并重復(fù)1次，收集的全部洗脫液于30℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，準(zhǔn)確加入2.50mL甲醇-水(4：6，V：V)，渦旋混勻，用0.22μm針孔式微孔濾膜過濾，待測。

1.6 色譜條件 采用Waters XBridge C18色譜柱(4.6mm×150mm，4.5μm)，柱溫為40℃，樣品室溫度為20℃，進樣體積為20.00μL。流動相為甲醇(A)、純水(B)和乙腈(C)的混合溶液，按表1中的流動相梯度洗脫條件對8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行洗脫分離。實樣測定過程中，如遇樣品中的雜質(zhì)峰對目標(biāo)物色譜峰有干擾，適當(dāng)調(diào)整流動相的梯度洗脫比例，使兩者達(dá)到基線分離。

表1 高效液相色譜流動相組成及梯度洗脫條件

1.7 柱后衍生熒光檢測系統(tǒng) 建立檢測8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的高效液相色譜-柱后衍生熒光檢測系統(tǒng)(圖1)，每一種氨基甲酸酯農(nóng)藥被色譜柱梯度洗脫分離后，在較高溫度下與強堿NaOH溶液在水解反應(yīng)盤管中發(fā)生水解反應(yīng)生成甲胺，甲胺與鄰苯二甲醛和巰基乙醇的混合溶液(OPA)在衍生反應(yīng)盤管中反應(yīng)轉(zhuǎn)變成具有強熒光相應(yīng)的異吲哚衍生物，進入熒光檢測器，在激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長465nm條件下進行檢測。水解試劑和衍生試劑管線的流量均為0.20mL/min，水解反應(yīng)盤管的加熱器溫度為80℃，衍生反應(yīng)盤管溫度為室溫。

圖1 高效液相色譜-柱后衍生熒光檢測系統(tǒng)

1.8 衍生試劑配制 水解試劑用0.05moL/L NaOH溶液(CB130)，使用前將衍生泵1的吸液管濾頭插入后即可使用。衍生反應(yīng)試劑為OPA溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，稱取0.10g 鄰苯二甲醛固體，加入10mL純甲醇溶解，1.0g巰基乙醇固體用適量OPA稀釋劑(CB910)溶解，將完全溶解后的鄰苯二甲醛和巰基乙醇溶液倒入OPA稀釋劑瓶中，蓋上瓶蓋，輕微振蕩混合均勻，再插入衍生泵2的吸液管。

2 結(jié)果討論

2.1 分離條件優(yōu)化 試驗初步選取甲醇(A)、純水(B)和乙腈(C)為流動相，試樣定容劑為甲醇-水(5：5，V：V)混合溶液，進樣體積為20.00μL，衍生泵流量均為0.30mL/min。由于涕滅威亞砜和的涕滅威砜具有非常強的極性，化學(xué)性質(zhì)非常相似，洗脫分離過程中兩者不容易達(dá)到基線分離，且易與樣品中含有的強極性干擾物的色譜峰重疊，故優(yōu)先選用了極性較強但洗脫能力較弱的甲醇+水(2：8，V：V)作為流動相的起始梯度。當(dāng)樣品中的強極性干擾物與目標(biāo)物基線分離后，增加流動相中乙腈比例，通過觀察8種農(nóng)藥的保留時間、峰形、相鄰峰之間的分離度、熒光響應(yīng)信號強度等來優(yōu)化液相色譜流動相的洗脫程序，結(jié)果(表1)。該條件下能夠?qū)?種氨基甲酸酯農(nóng)藥達(dá)到基線分離，圖2為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線色譜圖，22min內(nèi)所有目標(biāo)物全部洗脫分離出來?？梢?，用甲醇-乙腈-水混合體系進行梯度洗脫時，提高了流動相洗脫強度和效率，有效改善了色譜峰峰形，增加了色譜峰響應(yīng)信號，提高了色譜峰分離度，極大地縮短了樣品的上機檢測時間。

圖2 8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 樣品提取劑優(yōu)化 氨基甲酸酯類農(nóng)藥難溶于水，較易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑。因柑橘樣品中含有糖類、有機酸、維生素、色素及大量水分，為更充分地提取待測藥物，試驗選用能與水互溶的乙腈和甲醇為提取劑。試驗發(fā)現(xiàn)：甲醇提取樣品后，有機相和水相難于徹底分離；乙腈對不同極性農(nóng)藥均有很好的提取效果，利用鹽析法又能與水兩相分離，還可以除掉樣品提取液中的有機酸物、糖類及維生素等大部分雜質(zhì)，有利于下一步凈化。經(jīng)優(yōu)化后，選用10.00mL乙腈為提取劑。

2.3 提取方式優(yōu)化 初步選用超聲振蕩提取、均質(zhì)機勻漿提取、均質(zhì)儀振蕩提取方式對樣品進行處理。試驗發(fā)現(xiàn)：用高頻超聲波振蕩提取樣品超過40min后，水溫可升至60℃左右，可能會導(dǎo)致部分目標(biāo)物農(nóng)藥損失，每小時僅能處理樣品約40個；每個樣品如用高速勻漿機勻漿提取后，需要用水、丙酮+水(1：1，V：V)、水依次交替清洗勻漿機刀頭，溶劑耗損量大，過程耗時長，不便于快速提取大批量樣品，也容易造成樣品間的交叉污染；采用高速研磨均質(zhì)儀提取后，避免了樣品間的交叉污染，每小時可處理約200個樣品，極大地提高了樣品提取效率。綜合考慮，選用高速振蕩均質(zhì)儀振蕩提取樣品。

2.4 洗脫劑優(yōu)化 據(jù)文獻(xiàn)研究[9-10]，SPE-NH2小柱可有效地除掉提取液中的碳水化合物、有機酸、糖分、酚類、色素及極性化合物等干擾雜質(zhì)。用相同空白基質(zhì)配制目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用SPE-NH2對其進行凈化，以用不同體積比(1：99、3：97、5：95、7：93、10：90)的甲醇+二氯甲烷混合溶液為洗脫劑，考察了其對目標(biāo)物洗脫效果的影響。結(jié)果表明：當(dāng)洗脫劑中甲醇體積分?jǐn)?shù)增加，回收率基本穩(wěn)定。當(dāng)用6mL甲醇-二氯甲烷(5：95，V：V)為洗脫劑，分2次洗脫，目標(biāo)藥物附近的干擾峰較少且回收率接近100%。

2.5 樣品溶劑優(yōu)化 樣品溶劑不僅要完全溶解樣品中的待測農(nóng)藥，也要有利于減少溶解樣品中的干擾物，便于上機分析檢測。以純甲醇為樣品溶劑時，所得的色譜圖(圖3)?？梢园l(fā)現(xiàn)，較早洗脫出的涕滅威亞砜和涕滅威砜的色譜峰扭曲和變形了，而其余較之晚出峰的其他6種農(nóng)藥組分的色譜峰正常。涕滅威亞砜和涕滅威砜濃度越低，色譜峰展寬、扭曲、變形和分叉越嚴(yán)重，這是因為用強溶劑純甲醇溶解樣品時，樣品溶劑在柱內(nèi)可以看作流動相的一部分，溶解于強溶劑的洗脫帶，一部分樣品會被強溶劑迅速洗脫出色譜柱，另一部分在洗脫過程中溶于流動相，被流動相洗脫出，從而造成了色譜峰的展寬、扭曲和分叉，導(dǎo)致分析方法的準(zhǔn)確度和精密度下降。這種現(xiàn)象符合溶劑效應(yīng)[17]，當(dāng)樣品溶液的溶劑強度強于流動相強度時，造成較早洗脫的峰前沿、扭曲或開叉，而較晚洗脫的色譜峰則正常。

圖3 樣品溶劑對8種氨基甲酸酯農(nóng)藥色譜峰的影響(0.050mg/L)

另外，采用減小試樣進樣體積或用流動相梯度洗脫的初始比例溶液來溶解樣品可以減小或者消除“溶劑效應(yīng)”。當(dāng)進樣體積減小后，目標(biāo)物的熒光響應(yīng)信號值減小，方法靈敏度降低；用流動相的初始比例甲醇+水(2：8，V：V)溶解樣品時，由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥易溶于有機溶劑，不易溶于水，可能導(dǎo)致樣品溶劑不能完全溶解樣品中的強保留目標(biāo)物，導(dǎo)致重現(xiàn)性變差及回收率降低。經(jīng)優(yōu)化，選用甲醇+水(4：6，V：V)為樣品溶劑，不僅有效改善了加標(biāo)樣品中涕滅威亞砜和涕滅威砜的峰形，還降低了基線噪音，提高了分離度和熒光響應(yīng)值。

2.6 水解反應(yīng)溫度優(yōu)化 考察了柱后衍生系統(tǒng)中水解反應(yīng)盤管的加熱器(圖1)在30℃～100℃溫度范圍內(nèi)對目標(biāo)物熒光響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，當(dāng)加熱器溫度>70℃時，8種農(nóng)藥的熒光響應(yīng)值均達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定，表明色譜梯度洗脫分離后的目標(biāo)物與水解試劑NaOH完全反應(yīng)，最終確定水解反應(yīng)加熱器溫度為80℃。

2.7 衍生試劑流量及穩(wěn)定性 當(dāng)衍生試劑濃度一定時，其流量不僅決定從色譜柱中洗脫出的目標(biāo)物與衍生試劑的反應(yīng)程度，還會影響目標(biāo)物的峰展寬、峰高、分離度及分析速度。在0.10～0.50mL/min范圍內(nèi)，考察了衍生試劑流量的影響，結(jié)果表明：當(dāng)流量為0.20～0.40mL/min時，8種氨基甲酸酯農(nóng)藥與衍生試劑均完全反應(yīng)，產(chǎn)物的熒光響應(yīng)信號基本不變，峰形和分離度很好，為節(jié)省衍生試劑，確定衍生試劑流量均為0.20mL/min。另外，當(dāng)衍生試劑OPA使用時間超過5d，溶液略微發(fā)黃，目標(biāo)物的熒光響應(yīng)值也會降低，故OPA衍生試劑一定要現(xiàn)配現(xiàn)用，且避免陽光直射，建議放入瓦楞紙箱中，并在旁邊放入冰袋。

2.8 線性范圍和檢出限 分別準(zhǔn)確吸取一定體積的8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成10.0mg/L工作液，用甲醇+水(4：6，V：V)逐級稀釋成濃度為0.010、0.020、0.050、0.10、0.50、1.0mg/L一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，熒光響應(yīng)信號的峰面積為縱坐標(biāo)(y)進行線性擬合，結(jié)果(表2)，所擬合的直線線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 3～0.999 9，線性很好。為計算儀器信噪比(Signal-to-noise ratio，S/N)，在目標(biāo)物最低質(zhì)量濃度附近添加了一系列已知濃度的雙份樣品，測定其響應(yīng)信號，用S/N=3計算方法的檢出限為2～5μg/kg。

表2 8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限

2.9 回收率、精密度及定量限 選取篩選后的檸檬、春見、愛媛空白基質(zhì)，添加0.010、0.020、0.50mg/kg 3個濃度水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個試樣做3個平行質(zhì)控樣品，進行加標(biāo)回收率試驗。為模擬實樣檢測，向樣品中加入農(nóng)藥后，輕微渦旋振蕩離心管，密封過夜，次日按照1.3～1.7節(jié)條件進行檢測，分別計算回收率和精密度。柑橘空白基質(zhì)加標(biāo)色譜圖(圖4)，實驗結(jié)果(表3)，試樣加標(biāo)回收率均介于82.3%～105.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation，RSD)為2.7%～6.2%，回收率和精密度均符合“實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測”的分析要求[18]，滿足實樣檢測要求。經(jīng)加標(biāo)回收率試驗驗證，確定方法的定量限為0.010mg/kg。

圖4 柑橘空白基質(zhì)加標(biāo)色譜圖(0.010mg/kg)

表3 柑橘加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果(n=3)

續(xù)表

2.10 實樣檢測 應(yīng)用該方法對40個柑橘樣品進行篩查檢測，有2個批次樣品檢出克百威，其他7種農(nóng)藥組分均未檢出。為進一步確認(rèn)檢測結(jié)果，用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法GB 23200.121-2021[19]對陽性樣品進行了對比實驗，結(jié)果(表4)。兩種方法測定的樣品含量基本一致，相對誤差均<7%。查限量標(biāo)準(zhǔn)[20]，克百威在柑橘類水果中的最大允許殘留限量值為0.02mg/kg，第2個檸檬樣品超標(biāo)，后續(xù)跟進調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該種植戶使用了農(nóng)藥丁硫克百威，丁硫克百威易代謝生成克百威[21]，導(dǎo)致樣品中克百威殘留超標(biāo)。

表4 方法對比實驗結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜柱后衍生熒光法檢測柑橘中8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析方法，樣品經(jīng)乙腈提取、SPE-NH2固相凈化，利用柱后光化學(xué)熒光衍生系統(tǒng)極大地提高了方法的選擇性、靈敏度和抗干擾能力。該方法具有分離效果好、選擇性高、通用性強及檢出限低等優(yōu)點，回收率、精密度和定量限均能滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，適宜柑橘中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的同時檢測，也可為基層檢測機構(gòu)提供技術(shù)參考和借鑒。