李成蹊，關(guān)智宇，蔣太平，劉志倫，劉昭明

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550000；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，貴州 貴陽 550001)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵襲性關(guān)節(jié)滑膜炎為主要癥狀的自身免疫系統(tǒng)疾病，其具體病因未明[1]。特征為身體多關(guān)節(jié)的對稱性、侵蝕性炎癥，臨床表現(xiàn)有關(guān)節(jié)晨僵、腫脹、疼痛及功能障礙等癥狀(最常見于手、足小關(guān)節(jié))，實驗室檢查可見血清類風(fēng)濕因子陽性。如未得到恰當(dāng)治療，可能造成患者永久性骨質(zhì)破壞并最終出現(xiàn)殘疾，甚至累及臟器和神經(jīng)系統(tǒng)而危及生命[2]。目前臨床常見的治療RA藥物的主要局限性在于單一的靶向作用，這使得它們雖然可在短期內(nèi)改善患者的臨床癥狀，但長期的治療效果往往欠佳，且存在的不良反應(yīng)和較大的經(jīng)濟負擔(dān)使得很多患者不能維持用藥。故而探尋并利用長效、低毒、價廉的中草藥對RA患者進行治療，一直是近些年來臨床研究的一個熱點。

RA屬中醫(yī)“痹癥”“尪痹”范疇。中醫(yī)理論認為痹癥是由于體虛之人受到風(fēng)、寒、濕、熱等邪氣侵襲，進而使經(jīng)絡(luò)閉阻，氣血運行不暢，所謂“不通則痛”“不榮則痛”，最終導(dǎo)致肢體肌肉廢用，關(guān)節(jié)紅腫熱痛、變形等癥狀的一種疾病。在長期的臨床實踐過程中，我國古代醫(yī)家對此病有了較為系統(tǒng)的認知，在許多中醫(yī)典籍中都有對類似病癥的總結(jié)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》最早提出了風(fēng)、寒、濕三種外邪相合而致痹癥，《素問·痹論》[3]曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹也”；對風(fēng)濕的認知發(fā)展至宋代，有《太平圣惠方》云：“風(fēng)濕腰痛，連腿膝，頑痹不能運動”，《太平惠民和劑局方》[4]又載：“體虛，風(fēng)邪入血，肌膚頑痹”，都強調(diào)了體虛是痹病之根本原因，此后風(fēng)濕之邪從外侵犯而成痹證。從古至今中醫(yī)對RA的治法也以祛風(fēng)勝濕，通絡(luò)止痛為主?！吨袊幍洹穂5]記載絡(luò)石藤為夾竹桃科植物絡(luò)石[Trachelospermumjasminoides(Lindl.)Lem.]的干燥帶葉藤莖。味苦，性微寒。歸心、肝、腎經(jīng)。有祛風(fēng)通絡(luò)，涼血消腫的功效。中醫(yī)常將其用于風(fēng)濕痹癥、腰痹筋攣、紅腫熱痛、跌撲損傷等治療?！侗静菥V目》[6]有載：“絡(luò)石，氣味平和，其功主筋骨關(guān)節(jié)風(fēng)熱癰腫”。通過長期的臨床實踐，人們發(fā)現(xiàn)在古今眾多經(jīng)方運用過程中，絡(luò)石藤往往可有效延緩各種關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展，改善患者臨床癥狀。但由于中草藥的成分混雜、機制不明等原因，其類似“黑箱理論”的運作形式在多種臨床疾病治療過程中的作用依然受到質(zhì)疑。本文旨在運用現(xiàn)代化的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，分析絡(luò)石藤所含的主要活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其可能的作用機制，為明確絡(luò)石藤對于RA的治療效果提供數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要軟件與數(shù)據(jù)庫 Cytoscape 3.8.0、R語言、perl document、ChemBio3D Ultra、PyMOL、AutoDockTools、Vina、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)、GeneCards基因數(shù)據(jù)庫、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、PubChem數(shù)據(jù)庫、Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、STRING蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)庫、PubChem有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫、RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)。

1.2 絡(luò)石藤活性成分及作用靶點的篩選 在TCMSP中，以“絡(luò)石藤”為檢索詞，獲取絡(luò)石藤已知的藥物成分，將口服生物利用度大于等于30%(OB≥30%)，化合物類藥性大于等于0.18(DL≥0.18)設(shè)定為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到絡(luò)石藤所含化合物中活性度較高的成分，之后利用數(shù)據(jù)庫進一步搜索這些成分所作用的靶點基因，再將藥物所有的作用靶點導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫進行比對、去重后，獲得絡(luò)石藤可作用的靶點基因名稱。

1.3 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點的篩選 在GeneCards、OMIM兩種數(shù)據(jù)庫中同時檢索關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”，將檢索物種設(shè)定為“homo sapiens(人類)”，得到較為全面的RA疾病人源靶點基因。

1.4 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 得到絡(luò)石藤活性成分作用靶點與RA潛在靶點基因后，運行perl document程序獲取“藥物-疾病”交集靶點，再利用R語言將交集靶點輸出為Venn圖，運用Cytoscape 3.8.0軟件將絡(luò)石藤及其活性成分、RA及其靶點基因之間的作用關(guān)系進行可視化分析。

1.5 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建 檢索STRING數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入“藥物-疾病”交集靶點，生成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)后，將網(wǎng)絡(luò)圖保存為TSV格式的數(shù)據(jù)文件后導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0中進行篩選，得到絡(luò)石藤活性成分作用的核心靶點基因。

1.6 分子對接 首先使用PubChem數(shù)據(jù)庫搜索核心靶點對應(yīng)的活性成分，導(dǎo)入ChemBio3D Ultra軟件繪制活性成分的3D結(jié)構(gòu)，得到小分子配體文件。之后從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)下載核心靶點的三維結(jié)構(gòu)，用PyMOL軟件刪除配體并除水，得到蛋白受體文件。將二者導(dǎo)入AutoDockTools進行加氫修飾，設(shè)定搜索范圍和評分參數(shù)，形成活性口袋。最后利用Vina軟件進行分子對接。

1.7 GO富集分析與KEGG通路富集分析 下載Bioconductor程序包并利用R語言運行，對之前獲取的“藥物-疾病”交集靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析，將閾值設(shè)定為P<0.05以提高分析準(zhǔn)確性，將分析結(jié)果按照涉及的靶點數(shù)目從高到低進行排列，選取GO富集分析中生物過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF)的前10 個條目及KEGG通路富集的前20 個信號通路，進一步探討絡(luò)石藤治療RA的生物學(xué)過程及其作用的信號通路。

2 結(jié)果

2.1 絡(luò)石藤活性成分及作用靶點 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索出絡(luò)石藤25 個已知化學(xué)成分，再將OB≥30%和DL≥0.18設(shè)置為篩選條件，最終得到9 個活性度較高的化合物，可推測為絡(luò)石藤活性成分(見表1)。將活性成分導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲取每個活性成分所作用的靶點基因，為避免不同活性成分存在重復(fù)的作用靶點，故將全部靶點基因利用UniProt數(shù)據(jù)庫進行比對、去重，獲得90 個絡(luò)石藤治療RA的潛在靶基因名稱。

表1 絡(luò)石藤活性成分

2.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”，物種設(shè)定為“homo sapiens”，得到RA的人源靶點基因4 427 個，結(jié)合絡(luò)石藤治療RA的潛在靶點，運行perl document取“藥物-疾病”交集靶點，利用R語言輸出為Venn圖，發(fā)現(xiàn)67 個絡(luò)石藤作用靶點與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎重合的靶點基因。

2.3 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物活性成分和疾病交集靶點導(dǎo)入Cystoscope 3.8.0軟件，得到“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖1)。網(wǎng)絡(luò)圖中共包含158 個節(jié)點，其中六邊形代表藥物，矩形代表藥物活性成分，橢圓形代表靶點，菱形代表疾病，連接線表示兩個元素之間存在相互關(guān)系。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中絡(luò)石藤活性成分與疾病靶點連接度的多少篩選出排名前四的有效活性分子，分別為木犀草素、伊博格堿、谷甾醇、豆甾醇，各有8 個以上的靶點基因與這些成分發(fā)生作用，推測是絡(luò)石藤在RA治療中起主要作用的活性成分，體現(xiàn)了中藥多靶點的特性。

2.4 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建 檢索STRING數(shù)據(jù)庫，將范圍設(shè)為“Multiple proteins”，物種設(shè)為“Homo sapiens”，導(dǎo)入“藥物-疾病”交集靶點，初步生成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)后，調(diào)整“minimum required interaction score”為0.9并隱藏游離靶點，其余參數(shù)為默認值，繪制更明晰的蛋白互作關(guān)系(見圖2)，節(jié)點之間連線越粗代表互作關(guān)系越密切。將互作網(wǎng)絡(luò)保存為TSV格式的數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0中對靶蛋白作用程度進行打分，篩選兩次后得到6 個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心基因(見圖3)，分別為RB1、MAPK1、AKT1、JUN、IL-6、RELA，確定為絡(luò)石藤活性成分作用的核心靶點。

圖1 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心基因篩選

2.5 分子對接 將篩選出的6 個核心靶點與絡(luò)石藤活性成分進行分子對接驗證，其結(jié)果見表2，可見木犀草素是與6 個核心靶點對接的活性成分，運用PyMOL軟件輸出對接模式圖(見圖4)。分子對接的結(jié)合能(affinity)越小，表示配體與受體結(jié)合的越牢固。對接結(jié)果顯示，絡(luò)石藤活性成分與RA核心靶點的結(jié)合能介于-7.7 kcal·mol-1與-9.8 kcal·mol-1之間(低于-5.0 kcal·mol-1)，表明活性成分與核心靶點具有較好的結(jié)合活性，預(yù)測結(jié)果比較可靠。

表2 活性成分與核心靶點對接結(jié)果

圖4 絡(luò)石藤活性成分與RA核心靶點對接模式

2.6 GO富集分析與KEGG通路富集分析 將篩選出的67 個“藥物-疾病”交集靶點進行GO富集分析與KEGG通路富集分析，制作富集圖形。本次GO富集分析共顯示1 888個生物過程(BP)、84 個細胞組成(CC)、91 個分子功能(MF)，各取其中前10 個條目進行可視化分析(見圖5)。交集靶點基因在BP富集過程中主要表現(xiàn)在對生物堿的反應(yīng)(response to alkaloid)、肌肉細胞增殖(muscle cell proliferation)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖(regulation of smooth muscle cell proliferation)、對金屬離子的反應(yīng)(response to metal ion)、腺體發(fā)育(gland development)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)、對類固醇激素的反應(yīng)(response to steroid hormone)、對活性氧的反應(yīng)(response to reactive oxygen species)等生物過程；在CC富集過程中主要表現(xiàn)為突觸后膜(postsynaptic membrane)、突觸膜(synaptic membrane)、突觸前膜(presynaptic membrane)、細胞膜筏(membrane raft)、細胞膜微區(qū)(membrane microdomain)、細胞膜區(qū)(membrane region)等細胞組成；在MF富集過程中主要表現(xiàn)在兒茶酚胺結(jié)合(catecholamine binding)、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、藥物結(jié)合(drug binding)、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(neurotransmitter receptor activity)、肽結(jié)合(peptide binding)等分子功能。

圖5 絡(luò)石藤治療RA的GO富集分析

本次KEGG通路富集分析顯示了125 條通路，取前20 個條目進行可視化分析(見圖6)。交集靶點主要富集于PI3K-Akt信號通路、多種癌癥相關(guān)通路、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、HIF-1信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路等，多為癌癥、感染、炎癥和免疫相關(guān)通路。

圖6 絡(luò)石藤治療RA的KEGG通路富集分析

3 討論

經(jīng)過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選后，本次研究共得到絡(luò)石藤中9 個藥動學(xué)特征良好的化合物作為潛在活性成分，通過“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖反映出其中木犀草素、伊博格堿、谷甾醇、豆甾醇4個成分可能為發(fā)揮RA治療作用的關(guān)鍵成分。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。Aziz等[7]通過體內(nèi)及體外實驗證實了木犀草素具有較好的抗炎作用，其主要通過NF-κB、MAPK通路發(fā)揮作用。徐強等[8]認為木犀草素可以通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達，防止軟骨降解，促進新合成的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的積累，并抑制滑膜成纖維細胞增殖，最終緩解關(guān)節(jié)部位的炎癥反應(yīng)。部分關(guān)于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的實驗也證實了木犀草素緩解試驗?zāi)Ｐ妥沲钻P(guān)節(jié)腫脹的作用，是通過下調(diào)IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α等的水平達到的[9]。谷甾醇是植物甾醇的重要組成成分，其作用于多種慢性疾病，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等作用[10]。Liao等[11]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體NLRP3的激活，來抑制CAS1的產(chǎn)生及MAPK信號通路的活化，從而顯著減少細胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成以起到抗炎作用。曾莉萍等[12]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可使成骨細胞護骨素與破骨細胞分化因子的比值增高，發(fā)揮雌激素樣作用，促進卵巢顆粒細胞分泌雌二醇，從而與骨膜上的雌激素受體結(jié)合，促進成骨作用以及抑制破骨作用來調(diào)節(jié)女性骨代謝的平衡。關(guān)于豆甾醇及伊博格堿的相關(guān)文獻報道較少，豆甾醇的作用主要涉及抗癌方面，而伊博格堿主要用于阻斷某些藥物或毒品的依賴性，本文不做詳細討論。故推測木犀草素和谷甾醇為絡(luò)石藤抗RA的關(guān)鍵活性成分。

而分子對接的結(jié)果也表明，在通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點基因RB1、MAPK1、AKT1、JUN、IL-6、RELA中，絡(luò)石藤活性成分木犀草素與核心靶點具有較好的結(jié)合活性，進一步證實了絡(luò)石藤藥物成分可以與受體穩(wěn)定結(jié)合并發(fā)揮治療RA的作用，為絡(luò)石藤作用于核心靶點以干預(yù)RA病情提供了更多數(shù)據(jù)支持。

在篩選出的核心靶點基因中，又以MAPK1、AKT1、JUN三個基因的自由度最高。MAPK(基質(zhì)金屬蛋白酶)信號通路是經(jīng)典的炎性反應(yīng)通路，有研究表明，對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠給予MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑后，與未給信號通路抑制劑的對照組相比，給藥組在抑制滑膜炎癥、骨質(zhì)破壞和關(guān)節(jié)軟骨破壞的方面有顯著效果[1]。說明該信號通路對炎癥、增生和骨破壞這三大RA病理過程均起到重要的調(diào)節(jié)作用。AKT1可通過磷酸化其下游底物來促進細胞生長、代謝、凋亡等重要的細胞生物學(xué)過程[13]。JUN(轉(zhuǎn)錄因子AP-1)主要由C-Fos家族和C-jun家族結(jié)合形成的二聚體構(gòu)成，JUN位于多條信號通路的下游，主要調(diào)控炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-1、IL-6、IL-17等)和金屬蛋白酶(MMPs)等的釋放，參與細胞增殖、分化、凋亡，影響機體的免疫和炎性反應(yīng)[2]。

GO富集分析結(jié)果表明，絡(luò)石藤對RA的治療過程包括了金屬離子、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)的參與，涉及細胞器、細胞膜細胞，可影響肌肉細胞增殖、藥物結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、肽結(jié)合，對各種有機環(huán)狀化合物反應(yīng)、對生物堿反應(yīng)、對非生物刺激反應(yīng)、對類固醇激素反應(yīng)和對含氧化合物等反應(yīng)的一個復(fù)雜的過程。KEGG通路富集分析可歸納靶基因作用于疾病時所途徑的信號通路，便于更加清稀、明確地總結(jié)藥物發(fā)揮治療作用的過程。IL-17在RA患者病理活檢中均可檢測到，且研究表明IL-17是通過PI3K-Akt途徑刺激RA-FLS分泌IL-6、IL-8及血管內(nèi)皮細胞生長因子受體(VEGFR)[14-15]。而更多研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt可以通過影響FLS的增殖與凋亡干預(yù)RA滑膜炎癥，進行對TNF-α誘導(dǎo)B淋巴細胞誘導(dǎo)成熟蛋白1(Blimp 1)表達的調(diào)控干預(yù)RA骨破壞 ，其參與了RA進展的全部過程[16]。有研究表明[2]，RA成纖維樣細胞異常增生，并展現(xiàn)出了類癌細胞特點，RA纖維樣滑膜細胞異常增生可能與癌癥相關(guān)通路有關(guān)聯(lián)，絡(luò)石藤對多種癌癥相關(guān)通路的調(diào)控也可能對RA發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法，搜集到絡(luò)石藤9種活性成分及可能作用的90 個潛在靶點，4 427個RA疾病的相關(guān)靶點，其中包括“藥物-疾病”交集靶點67個，構(gòu)建關(guān)于這些靶點基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，發(fā)現(xiàn)絡(luò)石藤可能是通過作用于RB1、MAPK1、AKT1、JUN、IL-6、RELA等靶點發(fā)揮對RA的治療作用，分子對接顯示，其中發(fā)揮主要治療作用的活性成分為木犀草素。通過對核心靶進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，絡(luò)石藤可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路、癌癥相關(guān)通路、細胞凋亡通路、IL-17信號通路等通路，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能及調(diào)控細胞凋亡等作用來治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。這些結(jié)果通過數(shù)據(jù)證明了絡(luò)石藤治療RA的有效性，體現(xiàn)了中草藥治療特定疾病可以發(fā)揮多種要素協(xié)同作用的特點，也說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法運用于中醫(yī)藥研究的科學(xué)性和有效性。同時，本研究尚存在需要改進之處，如檢索的數(shù)據(jù)庫種類較少，所獲取的信息可能不完全，獲取的小分子配體及核心靶點數(shù)量有限，無法更加全面地揭示中草藥的藥理作用；作者查閱、引用的文獻及憑借網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)構(gòu)建的框架、列表、繪圖中存在對當(dāng)前研究熱點的傾向性，可能一定程度上影響到本次研究的結(jié)果，故得出的結(jié)論仍需進一步以實驗為基礎(chǔ)加以驗證，以更加準(zhǔn)確地揭示中藥絡(luò)石藤治療RA的具體作用機制。