孔瓊瓊 鄧濤

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升[1]。結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，通常確診時(shí)已屬中晚期，導(dǎo)致患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)[2-3]。因此深入探究結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制，尋找可提示預(yù)后及早期預(yù)警的分子標(biāo)志物具有重要意義。CD44是常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，是近期研究較多的腫瘤標(biāo)志物[4-7]。本研究比較并分析了結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞中CD44的表達(dá)情況，探討CD44的表達(dá)意義，以期為臨床診斷和治療結(jié)腸癌提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 CD44單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)邁新公司，結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NSM460購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，異硫氰酸酯（fluoresceine isothiocyanate,FITC）染色試劑盒和RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 病例資料 收集浙江省舟山醫(yī)院2021年1—12月經(jīng)手術(shù)切除的56例結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織及同一患者的癌旁組織。56例患者中男36例，女20例；年齡47～87（61.52±8.89）歲；Dukes分期A～B期24例，C～D期32例；組織分化程度低分化15例，中、高分化41例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查證實(shí)為結(jié)腸癌；均為首次診斷，未采取化療或放療等相關(guān)治療；具有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；臨床資料缺失。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織細(xì)胞CD44陽(yáng)性率檢測(cè) 采用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）法。取石蠟包埋的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，常規(guī)切片，脫蠟，脫水，抗原修復(fù)，山羊血清室溫封閉40 min，加入CD44一抗，4℃孵育過(guò)夜；加入二抗后室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染1 min。脫水、透明、封片后顯微鏡下檢查。由病理醫(yī)師讀取結(jié)果，以細(xì)胞膜棕黃色或棕褐色著色者為陽(yáng)性，每張切片選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)。依據(jù)Rahman等[6]標(biāo)準(zhǔn)，染色細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性，≥5%為陽(yáng)性。

1.3.2 HT29和NSM460中CD44陽(yáng)性率檢測(cè) 采用FITC染色法。HT29及NSM460均培養(yǎng)于含10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基中，采用0.02%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×107/ml，滅活兔血清封閉，加入CD44單抗1 μg，PBS溶液洗滌2次，每次5 min，滴加FITC標(biāo)記二抗。FITC可與蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團(tuán)相結(jié)合并顯示出黃綠色。依據(jù)染色細(xì)胞數(shù)量判斷CD44陽(yáng)性率，每組重復(fù)3次取平均值。

1.3.3 HT29和NSM460中CD44蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用Western blot法。分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29和NSM460，加入RIPA細(xì)胞裂解液冰浴裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白；以3 000 r/min離心6 min，收集上清液，采用BCA法測(cè)定總蛋白含量。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用3%FBS白蛋白封閉1 h后，加入CD44一抗，4℃過(guò)夜；使用含Tween 20的Tris緩沖鹽水漂洗，加入二抗，常溫孵育1 h，漂洗，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（efficient chemiluminescence kit,ECL）工作液，顯色，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（recombinant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4 觀察指標(biāo) （1）比較結(jié)腸癌組織和癌旁組織細(xì)胞CD44陽(yáng)性率；（2）比較不同病理特征結(jié)腸癌患者癌組織細(xì)胞CD44陽(yáng)性率；（3）比較兩組細(xì)胞中CD44陽(yáng)性率；（4）比較兩組細(xì)胞中CD44蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織細(xì)胞CD44陽(yáng)性率比較結(jié)腸癌組織細(xì)胞CD44陽(yáng)性37例（66.07%），癌旁組織8例（14.28%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=31.241，P＜0.05）。

2.2 不同病理特征結(jié)腸癌患者癌組織細(xì)胞CD44陽(yáng)性率比較 不同性別、年齡和腫瘤直徑癌組織中細(xì)胞CD44陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C～D期癌組織中細(xì)胞CD44陽(yáng)性率高于A～B期，低分化癌組織中細(xì)胞CD44陽(yáng)性率高于中、高分化癌組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中細(xì)胞CD44陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同病理特征結(jié)腸癌患者癌組織中細(xì)胞CD44陽(yáng)性率比較

2.3 兩組細(xì)胞CD44陽(yáng)性率比較 FITC染色結(jié)果顯示，HT29細(xì)胞CD44陽(yáng)性率（82.34%±6.56%）高于NSM460（23.14%±4.61%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.789，P＜0.05）。

2.4 兩組細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果顯示，HT29中CD44蛋白灰度值高于NSM460，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 HT29和NSM460中CD44蛋白表達(dá)的比較（a：蛋白電泳圖；b：蛋白灰度值）

3 討論

結(jié)腸癌發(fā)病原因復(fù)雜，通常認(rèn)為是遺傳因素與生活環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[8-10]。結(jié)腸癌發(fā)病率和病死率高，嚴(yán)重威脅人們生命安全。因此，臨床上采取科學(xué)有效的診治結(jié)腸癌方法具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在因素，在腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用[11-12]。CD44基因是惡性腫瘤標(biāo)志物，位于人類11號(hào)染色體短臂上，長(zhǎng)度約50 kb，編碼的CD44蛋白分子量為85～200 kDa。作為細(xì)胞黏附分子，CD44蛋白可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞向炎癥部位和黏膜相關(guān)組織的歸位、黏附細(xì)胞外基質(zhì)及淋巴細(xì)胞的歸巢等[13-17]。探索CD44在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中作用的相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)今后治療設(shè)計(jì)具有重要意義。目前，關(guān)于CD44具體作用結(jié)果仍存在較多爭(zhēng)議。劉振峰等[18]研究表明，非小細(xì)胞肺癌組織中CD44蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于肺部良性病變者。王瑩等[19]研究顯示，小細(xì)胞肺癌患者血清和腫瘤組織中可檢測(cè)到CD44的表達(dá)，體能狀態(tài)（physical strength,PS）2分的患者腫瘤組織中CD44陽(yáng)性率（85.71%）高于PS 0～1分患者（30.00%），疾病進(jìn)展患者血清CD44濃度明顯高于疾病控制患者，腫瘤組織CD44陽(yáng)性表達(dá)高于疾病控制患者，及腫瘤組織CD44陽(yáng)性患者無(wú)進(jìn)展生存期短于CD44陰性患者。由此可見(jiàn)，CD44可作為惡性腫瘤治療的靶點(diǎn)。本研究顯示，結(jié)腸癌組織CD44蛋白陽(yáng)性率高于癌旁組織，提示CD44蛋白在結(jié)腸癌組織中明顯高表達(dá)；C-D期患者癌組織CD44蛋白陽(yáng)性率高于A-B期，低分化患者癌組織CD44蛋白陽(yáng)性率高于中、高分化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織CD44蛋白陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的癌組織，提示CD44蛋白表達(dá)與與Dukes分期、組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；結(jié)腸癌細(xì)胞中CD44蛋白陽(yáng)性率和CD44蛋白灰度值均高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系，提示CD44蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中明顯高表達(dá)。

綜上所述，CD44在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞中均高表達(dá)。