林日旭 郭瑛 謝春明 黃卡特 李劍敏 陳國榮

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤中發(fā)病率排名第三，病死率排名第二。2018年全球CRC新發(fā)病例180萬，死亡病例88萬，預(yù)計(jì)到2030年，全球新發(fā)病例將超過220萬，相關(guān)死亡病例達(dá)110萬[1-3]。大量研究表明，CRC篩查和早診早治可以有效提高患者生存率，改善預(yù)后。目前，CRC篩查和早期診斷的方法有腸鏡檢查、糞便潛血試驗(yàn)（fecal occult blood test,FOBT）、糞便免疫化學(xué)檢測（faecal immunochemical test,FIT）等，其中腸鏡是發(fā)現(xiàn)腸腺瘤和腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于操作的侵入性，腸道準(zhǔn)備繁瑣，價(jià)格昂貴，存在腸道出血、腸壁穿孔、腸系膜、漿膜撕裂、內(nèi)臟破裂等風(fēng)險(xiǎn)，部分患者不易接受[4-5]。FOBT是目前唯一得到循證醫(yī)學(xué)證實(shí)的CRC篩查技術(shù)，但檢測靈敏度較低[6-8]。FIT相對FOBT檢測效率略有提升，但是漏診率和誤診率均較高[9]。糞便DNA基因檢測技術(shù)侵入性低、靈敏度高、技術(shù)簡單且方便，是CRC早期篩查的有效替代方法[10]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI）2A、分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled related protein,SFRP）2、組織因子途徑抑制劑（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）2、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）等基因的甲基化對CRC早期診斷具有重要價(jià)值[11]。重組人黏結(jié)蛋白聚糖2（syndecan-2,SDC2）基因位于人類8號染色體的長臂上，編碼SDC2蛋白，介導(dǎo)CRC細(xì)胞的黏附，進(jìn)而影響癌細(xì)胞增殖[12]。研究已證實(shí)SDC2是CRC細(xì)胞中主要甲基化位點(diǎn)之一，CRC患者的體液（例如血清和糞便）DNA中可檢測到甲基化的SDC2，是檢測早期CRC的非侵入性的潛在分子診斷標(biāo)志物[13-14]。本研究收集了CRC、結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤、干擾癌種患者及正常健康人群的糞便樣本進(jìn)行SDC2甲基化檢測，同時(shí)采用腸鏡檢查法進(jìn)行驗(yàn)證，以此評估人糞便SDC2甲基化檢測對CRC的靈敏度和特異度，進(jìn)而探究人糞便SDC2甲基化檢測在CRC早期篩查中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2019年7—10月經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為CRC、結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤及對照患者共計(jì)373例。依據(jù)腸鏡和（或）病理結(jié)果將研究對象分為病例組和對照組，病例組135例，包括CRC 88例，結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤47例；其中男91例，女44例，年齡（61.3±12.3）歲。對照組238例，包括腸癌術(shù)后患者26例，其他癌癥干擾病例35例（肺癌2例，甲狀腺癌4例，淋巴瘤2例，膀胱癌2例，前列腺癌1例，腎癌8例，食管癌9例，胃癌7例），其他腸道疾病患者61例（憩室6例，結(jié)直腸黑變病1例，痔瘡1例，結(jié)直腸息肉18例、結(jié)直腸炎癥13例、結(jié)直腸非進(jìn)展期腺瘤22例），腸道健康人群116例；其中男140例，女98例，年齡（50.6±14.3）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)腸鏡確診，其中結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤是指最大徑≥10 mm的腺瘤和直徑＜10 mm且絨毛成分或有高級別上皮內(nèi)瘤變或腺瘤成分≥25%的腺瘤；（2）合并有其他癌癥患者；（3）能提供足量（＞5 g）的新鮮糞便樣本。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）受試者在糞便樣本采集前30 d內(nèi)接受化療、放療或手術(shù)治療（CRC術(shù)后病例無該項(xiàng)要求）；（2）未嚴(yán)格按照糞便樣本采集裝置說明書要求采集的糞便樣本；（3）患者在腸鏡檢查過程中，進(jìn)行過腸鏡下息肉摘除術(shù)或套扎術(shù)。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審查號：2019-064），所有入組患者簽署知情同意書。

1.2 糞便采集及DNA提取 使用糞便采集裝置（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司）采集糞便并保存?zhèn)溆?；根?jù)DNA提取試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司）說明書方法提取糞便DNA，按照EpiTect Bisulfite kit（Qiagen公司）說明書方法進(jìn)行亞硫酸鹽氫鹽修飾。除進(jìn)展期腺瘤或腸癌患者可在腸鏡檢查后、手術(shù)治療前留取糞便樣本外，其余留取糞便樣本的時(shí)間均為腸鏡檢查前。

1.3 糞便SDC2基因甲基化檢測 按照SDC2基因甲基化檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，批號：11219070101Z）方法對修飾后的SDC2基因甲基化CpG簇進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測。甲基化特異引物為探針1：CGCGACTCCGCGCT，上游引物 1：GGTGAGTAGAGTCGGCGTAGT，下游引物 1：CTCCGAAAACCAATAAACGCCG，非甲基化特異引物為探針2：TCGAAAACTCGAACTCG，上游引物2：GAGGAGGAAGCGAGCGTTTTC，下游引物 2：GAAACAAAATACCGCAACGATTACGACTCAAAC。PCR擴(kuò)增體系：模板5.0 μl；酶0.3 μl；探針及引物35.0 μl。PCR擴(kuò)增程序：37℃ 10 min，95℃ 7 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 25 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)；93℃ 25 s，56℃ 35 s，72℃ 20s，30個(gè)循環(huán)。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 使用熒光素（fluorescein,FAM）標(biāo)記的熒光探針1指示SDC2基因甲基化信號，熒光染料（victoria,VIC）標(biāo)記的熒光探針2指示內(nèi)參基因β-肌動蛋白（β-actin）信號。測定各樣本中反應(yīng)液的ΔCt值（ΔCt=CtFAM-CtVIC），ΔCt＜10判定樣本為“陽性”；ΔCt≥10時(shí)判定樣本為“陰性”；若反應(yīng)液CtVIC＜21，且CtFAM信號為“No Ct”，則判讀為“陰性”。檢測結(jié)果解讀：“陽性”表示本次檢測受檢者存在SDC2高甲基化狀態(tài)，提示CRC、腸進(jìn)展期腺瘤可能；檢測結(jié)果“陰性”表示本次檢測受檢者存在SDC2低甲基化狀態(tài)，但不排除CRC、腸進(jìn)展期腺瘤或其他病變的可能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。計(jì)算糞便SDC2甲基化檢測的特異度、靈敏度和總符合率，特異度=真陰性例數(shù)（/真陰性+假陽性）例數(shù)；假陽性率=1-特異度；靈敏度=真陽性例數(shù)（/真陽性+假陰性）例數(shù)；假陰性率=1-靈敏度；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)（/真陽性+假陽性）例數(shù)；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)（/真陰性+假陰性）例數(shù)；總符合率=（真陽性+真陰性）例數(shù)/總樣本數(shù)；陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、總符合率的置信區(qū)間采用95%Wilson得分置信區(qū)間。以真陽性率（靈敏度）為縱坐標(biāo)，假陽性率（1-特異度）為橫坐標(biāo)繪制ROC曲線，計(jì)算AUC。采用Kappa檢驗(yàn)做一致性分析，Kappa值＜0.4說明一致性較差，0.4～0.6表示一致性中等，＞0.6說明有較好的一致性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組糞便SDC2甲基化檢測的靈敏度 88例CRC患者糞便SDC2甲基化檢測總靈敏度為0.841（95%CI：0.748～0.910），性別、年齡、臨床分期等各臨床特征的靈敏度為0.600～1.000，與總靈敏度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見表1。47例結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤患者糞便SDC2甲基化檢測總靈敏度為0.553（95%CI：0.401～0.698），性別、年齡等臨床特征的靈敏度為0.500～0.625，與總靈敏度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見表2。糞便SDC2甲基化檢測在CRC患者和結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤患者中的總靈敏度為0.741，假陰性率為0.259。

表1 不同臨床特征CRC患者糞便SDC2甲基化檢測的靈敏度分析（n=88）

表2 不同臨床特征結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤患者糞便SDC2甲基化檢測的靈敏度分析（n=47）

2.2 對照組糞便SDC2甲基化檢測的特異度 26例腸癌術(shù)后患者糞便SDC2甲基化檢測的特異度為0.808，35例其他癌癥干擾患者的特異度為0.743，61例其他腸道疾病患者的特異度為0.934，116例腸道健康人群的特異度為0.914。對照組238例樣本的總特異度為0.882（95%CI：0.835～0.920），假陽性率為 0.118?？梢娂S便SDC2甲基化檢測在其他腸道疾病患者及腸道健康人群中的特異度相對較優(yōu)，見表3。

表3 對照組糞便SDC2甲基化檢測的特異度分析

2.3 糞便SDC2甲基化檢測的總符合率及ROC檢驗(yàn)糞便SDC2甲基化檢測的陽性預(yù)測值為0.781（95%CI：0.702～0.844），陰性預(yù)測值為0.857（95%CI：0.808～0.896），總符合率為0.831（95%CI：0.790～0.866），見表4。ROC曲線顯示，糞便SDC2基因檢測的AUC為0.819，可見采用糞便SDC2檢測篩查CRC及結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤準(zhǔn)確性較高，見圖1。Kappa一致性檢測結(jié)果顯示，Kappa=0.63，P＜0.05，可見q-RT PCR檢測結(jié)果和腸鏡檢查法存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的一致性。

圖1 糞便SDC2基因檢測CRC及進(jìn)展期腺瘤的ROC曲線

表4 總?cè)虢M樣本列聯(lián)表

3 討論

CRC早期篩查對于疾病發(fā)現(xiàn)、治愈至關(guān)重要。腸鏡是目前診斷腸腺瘤和腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于腸鏡檢查操作具有侵入性，患者依從率較低[7]。FOBT與FIT檢測作為最為廣泛的CRC篩查技術(shù)，靈敏度和特異度均較低[8-9]。近年來，表觀遺傳學(xué)，如DNA甲基化，在腫瘤早期診斷中的作用受到重視，基于血液、糞便等生物樣本的精準(zhǔn)無創(chuàng)檢測成為結(jié)直腸腫瘤診斷的新選擇。最近研究顯示糞便SDC2甲基化檢測對CRC的靈敏度為0.774～0.838，在健康對照中的特異度為0.882～0.980[10，15-16]。本研究探索了糞便 SDC2甲基化作為CRC檢測的生物標(biāo)志物的可行性，結(jié)果顯示SDC2甲基化檢測在CRC中的靈敏度為0.841，在對照樣本（腸癌術(shù)后人群、其他癌癥干擾病例、其他腸道疾病患者、健康人群）中的特異度為0.882。這些數(shù)據(jù)表明SDC2甲基化檢測在CRC早期篩查中具有較高的特異度和靈敏度，可為不愿意接受腸鏡檢查的CRC風(fēng)險(xiǎn)人群提供新的選擇。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)IT檢測在腺瘤中的靈敏度為0.270[17]，糞便SDC2甲基化檢測在結(jié)直腸腺瘤患者中的靈敏度分別為0.582和0.421[15-16]，本研究也發(fā)現(xiàn)糞便SDC2甲基化檢測在47例結(jié)直腸進(jìn)展期腺瘤患者中的靈敏度為0.553，可見SDC2甲基化檢測在CRC癌前病變篩查中也具有指導(dǎo)意義。此外，本研究也納入了不同疾病的對照樣本，結(jié)果顯示糞便SDC2甲基化檢測在腸癌術(shù)后人群、其他癌癥干擾病例、其他腸道疾病患者、健康人群中均具有較高的特異度。這也揭示了該檢測方法可以明顯區(qū)分CRC患者與其他疾病人群，證實(shí)了該檢測方法在CRC患者篩查中的高特異度。

研究表明糞便SDC2甲基化水平隨著疾病嚴(yán)重程度的加深顯著升高[14]。本研究結(jié)果也表明SDC2的甲基化檢測的靈敏度隨著CRC臨床分期的增加而增加，但因樣本量較小，其結(jié)果不具有代表性。據(jù)報(bào)道，CRC的發(fā)病率隨年齡的增長而升高，并且在50歲后有較快的上升趨勢[18]。本研究發(fā)現(xiàn)糞便SDC2甲基化檢測在兩個(gè)年齡段（＜50歲，≥50歲）中均具有較高的靈敏度，表明了該檢測方法在各年齡階段CRC患者及腺瘤患者中都具有較高的適用性。

總之，糞便SDC2基因甲基化檢測對于CRC篩查具有較高的靈敏度和特異度，并且與腸鏡檢查具有較高一致性。因此，糞便SDC2基因甲基化檢測有望成為CRC早期篩查的有效手段。