王 楠,張余華,吳玲利*,李建安*,唐潤鈺,王雅珺
(1.中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院/經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410004;2.湖南省南方丘陵山地生態(tài)經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410004;3.江西省井岡山市林業(yè)局,江西 吉安 343600)
【研究意義】油茶(Camellia oleiferaAbel.)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)常綠灌木或小喬木,是我國重要的木本食用油料樹種,與油桐、核桃和烏桕并稱我國4 大木本油料樹種[1]。茶油是優(yōu)質(zhì)的食用植物油之一,其不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%,含有角鯊烯、維生素E、甾醇等抗氧化活性物質(zhì),具有降血脂、降膽固醇、增強(qiáng)人體免疫力等保健作用[2-3]。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)對(duì)保障我國糧油安全及山區(qū)產(chǎn)業(yè)扶貧具有重大意義。油茶是一種自交不親和性植物,于秋冬季開花,花期經(jīng)常遭遇連續(xù)低溫陰冷天氣,引起座果率低、產(chǎn)量下降,嚴(yán)重制約了我國油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此,尋求油茶花期冷凍害防治的有效方法已成為油茶科學(xué)研究的重大課題?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來,大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)、油菜素內(nèi)酯(BR)等植物生長調(diào)節(jié)劑在提高植物抗寒性方面效果顯著,目前已經(jīng)在小麥[4]、香梨[5]、玉米[6]、番茄[7]等研究中得到證實(shí),但在提高油茶抗寒性方面的研究還較少。研究表明,噴施適當(dāng)濃度的外源ABA能夠顯著緩解低溫脅迫的傷害,在提高植物保護(hù)酶活性的同時(shí)也能夠積累較多的游離脯氨酸,從而提高了植物的抗寒性[8]。BR 作為一種新型的植物生長調(diào)節(jié)劑,可以有效降低低溫脅迫下MDA 對(duì)細(xì)胞膜的毒害作用,進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗寒性[9]。除激素類物質(zhì)外,Ca2+能夠促進(jìn)植物低溫脅迫下的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)抗寒基因表達(dá)來提高作物抗寒性[10]??购允侵参飳?duì)寒冷凍害長期適應(yīng)的一種遺傳特性,主要取決于植物自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和植物內(nèi)部的生理生化變化;植物的葉片是最先感受寒冷且對(duì)寒冷特別敏感的器官,當(dāng)受到低溫脅迫時(shí),植物葉片會(huì)調(diào)整自身的形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)以適應(yīng)低溫帶來的影響[11]。前人研究表明,葉片的解剖結(jié)構(gòu)和外部結(jié)構(gòu)都能反映植物的生理適應(yīng)性,其葉片的面積、厚度、氣孔大小以及柵海比、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度都與植物抗逆性存在一定的相關(guān)性,都可作為評(píng)價(jià)植物抗寒性的指標(biāo)[12]。【本研究切入點(diǎn)】目前,國內(nèi)外關(guān)于油茶抗寒性研究主要集中在低溫對(duì)油茶開花授粉的影響、幼苗抗寒生理響應(yīng)及品種抗寒性評(píng)價(jià)等方面,但缺乏花期抗寒相關(guān)研究,使得油茶花期冷凍害防御技術(shù)仍懸而未決?!緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)初花期葉片噴施3 種不同外源物質(zhì)進(jìn)行研究,探索利用外源物質(zhì)提高油茶花期葉片抗寒能力的可行性,以期為油茶花期冷凍害防御提供理論依據(jù)。
供試材料來自湖南天球三華油茶科技有限公司株洲苗木生產(chǎn)基地,油茶品種為‘華碩’,置于中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)大樓樓頂(湖南長沙,28°10′N,113°23′E)培育,并進(jìn)行相同的水肥管理。
選取長勢一致、生長健壯的4 年生油茶(苗木高度約為80 cm,地徑約為1 cm)為試驗(yàn)對(duì)象,待其進(jìn)入初花期后采用10 mmol/L 氯化鈣(CaCl2)、0.1 mg/L 油菜素內(nèi)酯(BR)、10 mg/L 脫落酸(ABA)對(duì)其葉片進(jìn)行噴施處理:于2020 年11 月1 日開始,07:00 氣孔剛打開時(shí),噴施上述3 種溶液各1 L,每2 d噴1 次,連續(xù)3 次,對(duì)照組(CK)噴施清水,以全部葉片均噴施到且液體自然滴落為宜。試驗(yàn)共4 個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3 株,總計(jì)36 株。噴施后放至6 ℃人工氣候室進(jìn)行低溫處理,在低溫處理7 d 后采集相同方位的葉片,采樣時(shí)間在10:00 左右,每個(gè)處理采取3 個(gè)樣,每個(gè)樣含有3~6 片葉,樣品采好后迅速用錫箔紙包住并貼好標(biāo)簽放入液氮中速凍30 min,然后放入超低溫冰箱中-80 ℃保存。
1.3.1 抗氧化酶活性測定 測定使用植物超氧化物歧化酶(SOD)ELISA 檢測試劑盒、植物過氧化物酶(POD)ELISA 檢測試劑盒、植物多酚氧化酶(PPO)ELISA 檢測試劑盒、植物谷胱甘肽還原酶(GR)ELISA檢測試劑盒,每個(gè)處理重復(fù)3次。
1.3.2 葉片可溶性糖含量和蔗糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量測定 測定使用植物可溶性糖(s-sugar)ELISA 檢測試劑盒、植物蔗糖(sucrose)ELISA 檢測試劑盒、植物可溶性蛋白質(zhì)(s-protein)ELISA 檢測試劑盒、脯氨酸(Pro)ELISA檢測試劑盒,每個(gè)處理重復(fù)3次。
1.3.3 葉片激素、丙二醛含量的測定 水楊酸(SA)含量的測定使用植物(SA)ELISA檢測試劑盒;丙二醛含量的測定使用植物丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒。
采用常規(guī)石蠟切片制作葉片樣本,每個(gè)處理3次重復(fù),每張切片各觀察3個(gè)視野,在OLYMPUS-BX53型顯微鏡及其成像系統(tǒng)下觀察、拍照,采用Image-Pro-plus軟件測量其葉片厚度(Leaf thickness,TL)、上表皮厚度(Upper epidermal thickness,TUE)、柵欄組織厚度(Palisade tissue thickness,TP)、海綿組織厚度(Spongy tissue thickness,TS)、下表皮厚度(Lower epidermal thickness,TLE),計(jì)算柵海比(P/S)=柵欄組織厚度(TP)/海綿組織厚度(TS)、組織結(jié)構(gòu)緊密度(Cell tense ratio,CTR)=柵欄組織厚度(TP)/葉片厚度(TL)×100%;組織結(jié)構(gòu)疏松度(Spongy ratio,SR)=海綿組織厚度(TS)/葉片厚度(TL)×100%;變異系數(shù)=(標(biāo)準(zhǔn)差/平均值)×100%。
用SPSS 25 軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用(One-way ANOVA)檢驗(yàn)其差異顯著性,結(jié)果均為3 次重復(fù)的平均值,用Origin 2018進(jìn)行作圖。
由圖1A 可知,與對(duì)照(CK)相比,油茶經(jīng)BR、ABA、CaCl23種不同外源物質(zhì)噴施后,葉片的SOD 活性分別提高了223.56%、165.01%、214.93%,其中BR 處理后的SOD 活性最高,其次是CaCl2、ABA 處理。BR處理后的SOD活性顯著高于CK和ABA處理,比ABA處理提高了22.09%,但與CaCl2處理間無顯著差異。由圖1B 所示,PPO 活性最高為ABA 處理,其次是BR、CaCl2處理,比這兩種處理分別提高了13.40%、16.57%,差異顯著,但這兩種處理間差異不顯著。
由圖1C和圖1D可知,經(jīng)BR、ABA、CaCl23種不同外源物質(zhì)噴施后,油茶葉片的POD活性和GR活性經(jīng)ABA 處理后都最高,兩種酶活性由大到小順序均為ABA、CaCl2、BR 和CK 處理。其中ABA 處理后的POD 活性比CaCl2、BR、CK 處理分別提高了7.86%、20.64%和134.00%,差異顯著;GR 活性分別提高了13.05%、20.31%和46.83%,但BR與CaCl2處理間差異不顯著。
圖1 不同外源物質(zhì)處理對(duì)低溫脅迫下油茶葉片抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of different exogenous substances on antioxidant enzyme activities in C.oleifera leaves under low temperature stress
由圖2A 可知,在BR、ABA、CaCl2不同外源物質(zhì)處理后,油茶葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量比對(duì)照組(CK)分別提高了72.10%、91.19%、和53.58%,差異顯著。其中經(jīng)ABA 處理后的可溶性蛋白質(zhì)最高,顯著高于BR、CaCl2處理,比BR和CaCl2處理分別提高了11.09%、24.49%。
由圖2B 所示,油茶經(jīng)CaCl2處理后葉片的pro 含量顯著高于CK 和BR 處理,比BR 處理提高了55.84%,但CaCl2和ABA 處理間無顯著差異。如圖2C可知,油茶葉片噴施不同外源物質(zhì)后的蔗糖含量大小順序?yàn)镃aCl2,ABA,BR,CK 處理;CaCl2處理后油茶葉片的的蔗糖含量顯著高于BR 和ABA 處理,顯著提高了12.24%、7.83%。圖2D 表明,CaCl2處理后的可溶性糖含量最高,其次是BR、ABA 處理,比這兩種處理分別提高了5.35%、11.40%,但CaCl2和BR處理無顯著差異,與ABA處理差異顯著。
圖2 不同外源物質(zhì)處理對(duì)低溫脅迫下油茶葉片可溶性蛋白、脯氨酸、蔗糖、可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of different exogenous substances on contents of soluble protein,pro,sucrose and soluble sugar in leaves of C.oleifera under low temperature stress
由圖3-A 可知,在BR、ABA、CaCl2噴施后,油茶葉片的SA 含量比對(duì)照組(CK)分別提高了8.83%、22.08%、和16.93%,差異顯著;其ABA 處理后的水楊酸含量上升最多,顯著高于CK、BR 處理,比BR 處理提高了12.18%,但與CaCl2處理間無顯著差異。
由圖3-B 可知,油茶噴施BR、ABA、CaCl23 種不同外源物質(zhì)后,葉片的MDA 含量比對(duì)照組(CK)分別降低了17.53%、16.98%和34.68%,差異顯著。在CaCl2處理后的MDA 含量顯著低于BR、ABA 處理,比兩者分別降低了20.79%,21.32%,但與這兩種處理間無顯著差異。
圖3 不同外源物質(zhì)處理對(duì)低溫脅迫下油茶葉片水楊酸、丙二醛的影響Fig.3 Effects of different exogenous substances on salicylic acid and MDA in C.oleifera leaves under low temperature stress
由表1 可以看出,本試驗(yàn)提取3 個(gè)主成分,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了100%,說明這兩個(gè)主成分保留了原始數(shù)據(jù)全部的信息量,因此選取前3個(gè)主成分作為評(píng)價(jià)不同外源物質(zhì)處理提高油茶抗寒性的綜合指標(biāo)。第一主成分的特征值為8.521,貢獻(xiàn)率達(dá)到了85.215%,絕對(duì)值較大的依次為POD、蔗糖、PPO 和水楊酸,充分說明了抗氧化酶、蔗糖和水楊酸與抗寒性的關(guān)系;第二主成分的特征值為0.895,貢獻(xiàn)率為8.947%,絕對(duì)值較大的依次為丙二醛、GR,主要表明兩者是反映植物抗寒性的主要因子;第三主成分的特征值為0.584,貢獻(xiàn)率為5.838%,絕對(duì)值較大的依次為脯氨酸、SOD。
表1 因子成分矩陣Tab.1 Factor component matrix
根據(jù)前3個(gè)主成分特征值及因子成分矩陣(表1),計(jì)算得出主成分載荷矩陣,如表2所示。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)及主成分函數(shù)公式,計(jì)算得出前3個(gè)主成分得分Y1、Y2、Y3,如表3所示;最終根據(jù)3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為權(quán)重計(jì)算出4 個(gè)處理的綜合得分Y,ABA、CaCl2、BR、CK 4 種處理的綜合得分分別為1.79、1.49、0.34、-3.62;由此可知,ABA、CaCl2、BR 3 個(gè)處理較CK 而言,綜合得分均有所提高,處理效果大小依次為ABA,CaCl2,BR,CK。
表2 主成分載荷矩陣Tab.2 Principal component load matrix
表3 前3個(gè)主成分得分Tab.3 Score of the first 3 principal components
2.5.1 葉片表皮特征比較 如表4 所示,在葉片厚度上,4 種處理均差異不顯著。與對(duì)照相比,油茶經(jīng)ABA、CaCl2處理后在低溫脅迫7 d的葉片柵欄組織厚度有顯著差異,而BR處理后的差異不顯著。同時(shí)從柵海比、組織緊密度、組織疏松度等多項(xiàng)指標(biāo)綜合比較來看,葉片柵欄組織厚度范圍平均為157.84~204.70μm,柵海比范圍平均為0.63~0.90,組織緊密度范圍平均為0.34~0.44,ABA 處理在柵欄組織厚度、柵海比、組織緊密度上均為最大值,組織疏松度為最小值,但均與CaCl2處理間無顯著差異。
表4 不同外源物質(zhì)處理后的油茶葉片組織結(jié)構(gòu)特征比較Tab.4 Comparison of leaf epidermis characteristics of Camellia oleifera treated with different exogenous substances
將不同外源物質(zhì)處理后的油茶‘華碩’葉片的8項(xiàng)解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖4所示。由圖4 可知,8 項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)可聚集為3 類:第1 類包括組織緊密度、組織疏松度、柵海比、上表皮厚度、下表皮厚度;第2類包括柵欄組織、海綿組織厚度;第3類包括葉片厚度。
圖4 8項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的聚類分析結(jié)果Fig.4 Cluster analysis result of eight leaf anatomic structure indexes
由表5可知,葉片厚度和海綿組織厚度呈極顯著正相關(guān),與柵欄組織厚度呈顯著正相關(guān)。柵欄組織厚度和CTR、柵海比呈極顯著正相關(guān)和SR 呈極顯著負(fù)相關(guān)。海綿組織厚度和SR 呈極顯著正相關(guān),和柵海比、CTR呈極顯著負(fù)相關(guān)。柵海比和CTR、SR分別呈極顯著正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。CTR和SR呈極顯著負(fù)相關(guān)。
根據(jù)相關(guān)指數(shù)的大小確定各類指標(biāo)中的典型指標(biāo),相關(guān)指數(shù)的計(jì)算公式為:Ri2=Σr2/(n-1)。式中:Ri2為每類別指標(biāo)的相關(guān)指數(shù);i為某類指標(biāo),i=1,2,…n,n為每類指標(biāo)的個(gè)數(shù);r為同類指標(biāo)中各相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)。葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)矩陣見表5,在同一類別指標(biāo)中,相關(guān)指數(shù)最大的指標(biāo)即為該類指標(biāo)中的典型指標(biāo)。若相關(guān)指數(shù)相等,同類指標(biāo)中選取變異系數(shù)最大的指標(biāo)作為典型指標(biāo)。根據(jù)相關(guān)系數(shù)計(jì)算出的3個(gè)類別指標(biāo)的相關(guān)指數(shù),然后根據(jù)相關(guān)指數(shù)大小對(duì)其進(jìn)行排序,結(jié)果見表6。由表6可知,3類指標(biāo)中的典型指標(biāo)分別為:第1類為柵海比;第2類為柵欄組織厚度;第3類為葉片厚度。
表5 葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)矩陣Tab.5 Correlative matrix of leaf structure parameters
表6 葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)及排序Tab.6 Correlation indexes and ranking of leaf structure indexes
采用隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)不同外源物質(zhì)處理后的油茶耐寒性;根據(jù)篩選的3 項(xiàng)典型指標(biāo)計(jì)算平均隸屬度,數(shù)值越大則表明其耐寒性越好。由表7 可知,不同外源物質(zhì)處理后的油茶耐寒性由強(qiáng)到弱依次為ABA,CaCl2,BR,CK。
表7 不同外源物質(zhì)處理后的油茶耐寒性的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.7 Comprehensive evaluation results of cold resistance of Camellia oleifera treated with different exogenous substances
2.5.2 葉肉組織結(jié)構(gòu)特征分析 從圖5中可以觀察到,經(jīng)ABA、CaCl2處理后的油茶‘華碩’的葉肉結(jié)構(gòu)有三層?xùn)艡趯蛹?xì)胞,柵欄組織細(xì)胞為較細(xì)長的長柱形且排列較為緊密,其與柵欄組織相鄰的海綿組織排列較疏松;柵欄層細(xì)胞排列越緊密,其耐寒能力越強(qiáng)。而BR 處理和對(duì)照組(CK)的葉肉結(jié)構(gòu)只有兩層?xùn)艡趯?,但BR處理的柵欄層明顯比CK排列緊密。
圖5 不同外源物質(zhì)處理后油茶‘華碩’葉片的橫切面Fig.5 Cross-section of leaves of Camellia oleifera cultivars‘Huashuo’treated with different exogenous substances
低溫是影響植物生長發(fā)育和地理分布的一個(gè)重要因子,外源物質(zhì)處理可以增加抗氧化物質(zhì)的含量和細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以使植物適應(yīng)寒冷環(huán)境[13]。植物受到低溫脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS),此時(shí)植物通過增強(qiáng)抗氧化酶活性迅速清除體內(nèi)的自由基來減少膜脂化傷害,POD、PPO、GR等作為重要的保護(hù)酶可以加強(qiáng)抗氧化作用從而減少低溫的傷害提高抗寒性[14];周琳等[15]研究表明低濃度的ABA處理茶苗有利于抗氧化酶活力的提高從而增強(qiáng)抗逆性。李亮等[16]人發(fā)現(xiàn)低溫下SA的積累可以在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)碳同化關(guān)鍵酶基因的表達(dá),從而減輕低溫脅迫對(duì)光合作用的抑制來緩解低溫脅迫對(duì)植株的損傷。從本試驗(yàn)結(jié)果來看,油茶噴施3 種外源物質(zhì)后的葉片POD、PPO、GR 活性和SA 含量顯著高于對(duì)照,其中10 mg/L ABA 處理均為最大值,由此說明噴施3 種外源物質(zhì)都提高了油茶葉片的抗寒性,且10 mg/LABA 處理對(duì)油茶保護(hù)酶活性的增強(qiáng)和提高SA 含量效果最佳,但最適濃度和對(duì)其他內(nèi)源激素的影響還需進(jìn)一步研究。
MDA 作為膜脂過氧化的產(chǎn)物,其含量可以反映植物受脅迫的程度[17]。而滲透調(diào)節(jié)是植物逆境脅迫下的主要調(diào)節(jié)方式,脯氨酸、可溶性糖等作為植物受到脅迫下重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),當(dāng)?shù)蜏孛{迫來臨時(shí)其含量會(huì)顯著增加,來維持細(xì)胞膜的滲透調(diào)節(jié)功能以此來適應(yīng)脅迫環(huán)境[18]。本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫前用10 mmol/L CaCl2處理后的油茶葉片,MDA 含量顯著低于其余兩種處理,同時(shí)其脯氨酸、蔗糖、可溶性糖含量均最高,表明10 mmol/LCaCl2處理能更有效降低膜脂過氧化的程度和提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來緩解低溫傷害。但由于植物抗逆性是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程,且各生理生化指標(biāo)受到逆境影響和響應(yīng)的程度也大不相同,利用單一指標(biāo)去評(píng)價(jià)植物的抗逆性存在局限性,因而需要應(yīng)用多種指標(biāo)去綜合評(píng)價(jià)不同處理對(duì)植物逆境的緩解效果。本試驗(yàn)通過對(duì)10個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)蔗糖作為第一主成分的典型指標(biāo)貢獻(xiàn)率較大,由此說明糖類物質(zhì)除可溶性糖外蔗糖也可以作為抗寒性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo);根據(jù)最終的得分表明3種不同外源物質(zhì)處理均提高了油茶的抗寒性,其中10 mg/LABA處理得分最高,抗寒效果最好。
大量研究表明,除生理生化指標(biāo)外,植物葉片解剖結(jié)構(gòu)也可以反映植物的抗寒性,柵欄組織厚度越大且排列緊密以及柵海比越大則其耐寒性越好[19-20]。本研究通過聚類分析、相關(guān)指數(shù)及排序篩選出葉片厚度、柵欄組織厚度、柵海比作為抗寒性的3項(xiàng)典型指標(biāo)。通過試驗(yàn)結(jié)果分析,各處理間油茶葉片厚度差異不顯著,這可能是由于材料品種一致且低溫脅迫時(shí)間較短造成的;與對(duì)照相比,油茶葉片噴施不同外源物質(zhì)后柵欄組織均有所增厚,而從葉片的橫切面來看,其中ABA、CaCl2處理比CK、BR處理明顯多了一層?xùn)艡诮M織且排列更為緊密,同時(shí)伴隨著海綿組織厚度的減少柵海比增加,這說明3 種外源物質(zhì)處理都提高了油茶葉片的耐寒性。
3種外源物質(zhì)處理均能提高油茶葉片抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及改變?nèi)~片組織結(jié)構(gòu)來緩解低溫傷害,其中效果最顯著的是10 mg/L ABA 處理。本試驗(yàn)利用外源物質(zhì)提高油茶花期葉片抗寒性,為油茶花期冷凍害防御提供參考依據(jù)。