楊鳳梅 李洋杰 吳利 劉杰 孫璐 張卓

沈陽醫(yī)學(xué)院1公共衛(wèi)生學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（沈陽 110034）；3遼寧省疾病預(yù)防控制中心放射衛(wèi)生所（沈陽 110015）

氟是人體正常生長發(fā)育過程中必不可少的微量元素[1-3]。自然環(huán)境中氟化物含量豐富，飲用水是人體氟化物的主要來源?，F(xiàn)已證明，在推薦劑量下的氟攝入對機體健康是有益的，對骨骼和牙齒的礦化起著至關(guān)重要的作用。然而，過量氟攝入可引起慢性氟中毒，引發(fā)骨骼和關(guān)節(jié)周圍組織的一系列特征性變化，并導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的運動功能障礙[4-6]。已有實驗表明低濃度氟中毒促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，高濃度氟中毒則抑制成骨細(xì)胞的增殖[7]。目前，氟中毒的發(fā)病機制尚未明確，也缺乏行之有效的防治藥物，特別是在氟中毒流行地區(qū)，氟攝入過量受累人數(shù)眾多，這已然引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

丁酸鈉是丁酸的鈉鹽形式之一，丁酸現(xiàn)已被證明影響成骨細(xì)胞的增殖與分化[8]。研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉與機體健康密切相關(guān)，在調(diào)節(jié)腸道健康、提高免疫力及抗炎抑癌等方面意義重大[9-11]。丁酸鈉抑制牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligment stem cells，PDLSCs）的成骨細(xì)胞分化能力作用已被證實[12]。隨著研究深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)[13-14]，丁酸鈉在預(yù)防實驗性大鼠骨質(zhì)疏松和刺激人成骨細(xì)胞礦化等方面有積極作用。由于目前關(guān)于丁酸鈉對氟中毒小鼠的拮抗作用尚不清楚。因此，本研究旨在觀察丁酸鈉對氟中毒小鼠骨代謝及骨顯微結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步探索防治氟中毒性骨病的有效方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物清潔級初斷乳雄性ICR小鼠24只，體質(zhì)量（20±2）g，購自遼寧長生生物科技有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001，飼養(yǎng)于沈陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，溫度（24±2）℃，相對濕度（55±5）%，小鼠自由飲水、進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)入正式實驗。本實驗經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（批號：SYYXY2021031502）。

1.1.2 主要試劑與儀器氟化鈉（NaF）（Sigma，美國，純度% ≥ 99%）；丁酸鈉（SB）（Macklin，中國，純度 ≥98.5%），均為白色粉末狀；Micro-CT（Sky-Scan1276，Switzerland）；YLS-16A 小動物骨強度測定儀（YLS-16A，濟南益延）；原子吸收儀（AA-7000，日本島津）；氟離子選擇電極（PXS-270，上海雷磁）。

1.2 方法

1.2.1 動物處理24只初斷乳雄性ICR小鼠，按照體質(zhì)量均衡的原則隨機分為對照組、氟中毒組（100 mg/L NaF）、丁酸鈉組（100 mg/L NaF+500 mg/kg丁酸鈉）3組，每組8只。對照組小鼠飲用蒸餾水，氟中毒組和丁酸鈉組小鼠飲含F(xiàn)-濃度為100 mg/L的蒸餾水，各組均飼普通飼料，持續(xù)13周；隨后，丁酸鈉組每只小鼠按500 mg/kg丁酸鈉灌胃，對照組和氟中毒組則以生理鹽水灌胃，各組攝食飲水方式與前期保持不變，持續(xù)時間7周。動物實驗結(jié)束后，各組小鼠脫頸處死，取左側(cè)股骨和脛骨，剔除肌肉組織后，用生理鹽水濕潤的紗布包裹，封袋后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Micro-CT將處理好的股骨垂直放置于標(biāo)本管內(nèi)，用濕紙巾纏繞固定，Micro-CT掃描后，采集的樣本數(shù)據(jù)集使用配套軟件進(jìn)行分析并三維重構(gòu)。股骨遠(yuǎn)骨端骨小梁掃描選擇距生長板0.215 mm，厚度為1.72 mm的骨髓腔區(qū)域。骨小梁物理參數(shù)如下：骨小梁骨密度（trabecular bone mineral density，Tb.BMD），骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume，BV/TV）能夠反映不同樣本骨小梁骨量的多少，骨小梁厚度（trabecula thickness，Tb.Th）表示骨小梁平均厚度，骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N）代表感興趣區(qū)域中，每mm中骨組織與非骨組織交點數(shù)量的平均值，骨小梁間隙（trabecular separation，Tb.SP）表示骨小梁之間髓腔平均寬度，Tb.Th、Tb.N、Tb.SP是評價骨小梁空間形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要指標(biāo)，骨小梁結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（structure model index，SMI）描述小梁結(jié)構(gòu)組成結(jié)構(gòu)中板層結(jié)構(gòu)和桿狀結(jié)構(gòu)比例的參數(shù)，發(fā)生骨質(zhì)疏松時，骨小梁從板狀向桿狀轉(zhuǎn)變，該值增大。Tb.Th、Tb.N、Tb.SP、SMI數(shù)值是由CTAn軟件分析得出的值。

1.2.3 骨結(jié)構(gòu)強度實驗取脛骨，經(jīng)室溫環(huán)境平衡1 h后，將其放入骨骼強度測定儀中進(jìn)行壓碎實驗，壓碎速率為1.2 mm/s，檢測骨組織結(jié)構(gòu)強度。

1.2.4 骨礦物質(zhì)含量測定股骨烘干、炭化后，轉(zhuǎn)移至550℃馬弗爐中，干法消化6 h。消化完全后，骨灰溶解于5%硝酸溶液中備用。原子吸收法測定股骨中鈣、鎂、鋅的含量，比色法測定股骨中磷的含量，氟離子選擇電極法檢測股骨中氟的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。氟中毒組與對照組及丁酸鈉組與氟中毒組均采用獨立樣本t檢驗處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般情況實驗期間，各組小鼠無患病及死亡情況發(fā)生，攝食、飲水、皮毛及行為活動未見明顯差異，體質(zhì)量均呈現(xiàn)上升趨勢。實驗結(jié)束時，氟中毒組與對照組相比，小鼠終末體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）；丁酸鈉組與氟中毒組相比，小鼠終末體質(zhì)量明顯高于氟中毒組（P＜0.05），見圖1A。

圖1 各組小鼠終末體質(zhì)量和門齒變化Fig.1 Changes in final body weight and incisor of mice in each group

此外，對照組小鼠門齒表面光滑有光澤，牙面呈棕黃色，半透明狀，牙齒無破損，無氟斑牙形成（圖1B）；其他兩組小鼠均出現(xiàn)不同程度氟斑牙，氟中毒組左右門齒可見棕白橫紋，牙齒表面著色不勻（圖1C）；丁酸鈉組部分小鼠門齒光澤減退，表面粗糙，呈白堊樣改變（圖1D）。

2.2 各組小鼠骨小梁Micro-CT參數(shù)表1結(jié)果顯示，氟中毒組小鼠的Tb.BMD、BV/TV、Tb.N三項指標(biāo)均顯著低于對照組（P＜0.01或P＜0.05），而Tb.SP和SMI均明顯增高（P＜0.05）。丁酸鈉組與氟中毒組相比，丁酸鈉組各項指標(biāo)中，僅Tb.BMD顯著增高（P＜0.05）。

表1 各組小鼠股骨骨小梁物理參數(shù)Tab.1 Physical parameters of femoral trabecular bone of mice in each group ±s，n=3

表1 各組小鼠股骨骨小梁物理參數(shù)Tab.1 Physical parameters of femoral trabecular bone of mice in each group ±s，n=3

注：氟中毒組與對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；丁酸鈉組與氟中毒組比較，#表示P＜0.05

組別對照組氟中毒組丁酸鈉組SMI 1.02±0.29 1.72±0.12*1.67±0.05 TB.BMD（g/cm3）0.60±0.07 0.38±0.02**0.46±0.03#BV/TV（%）23.28±2.27 12.73±1.32**12.83±0.25 Tb.Th（mm）0.055±0.003 0.051±0.002 0.053±0.000 Tb.N（mm-1）4.10±0.67 2.23±0.38*2.45±0.18 Tb.SP（μm）0.18±0.02 0.28±0.04*0.25±0.01

2.3 各組小鼠骨小梁三維結(jié)構(gòu)由圖可見，對照組小鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)緊密，粗細(xì)均勻，連續(xù)性良好，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正常（圖2A）。氟中毒組骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏、粗細(xì)不均，部分區(qū)域出現(xiàn)骨小梁斷裂和缺失，呈現(xiàn)明顯的骨微結(jié)構(gòu)破壞（圖2B）。丁酸鈉組與氟中毒組相比，骨小梁結(jié)構(gòu)相對緊密，雖也呈現(xiàn)出骨微結(jié)構(gòu)破壞，但其程度相對較輕（圖2C）。

圖2 各組小鼠股骨骨小梁三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional structure of femoral trabecular bone of mice in each group

2.4 各組小鼠脛骨骨結(jié)構(gòu)強度生物力學(xué)測試結(jié)果顯示，氟中毒組小鼠的脛骨骨結(jié)構(gòu)強度顯著低于對照組（P＜0.01）。丁酸鈉組與氟中毒組相比，骨結(jié)構(gòu)強度高于氟中毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠脛骨骨結(jié)構(gòu)強度Fig.3 Tibia bone structure strength of mice in each group

2.5 各組小鼠股骨骨礦含量與對照組比較，氟中毒組小鼠骨鈣、骨鎂、骨鋅含量均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），骨氟和骨磷含量均明顯增高（P＜0.01）。丁酸鈉組小鼠骨鈣、骨鎂、骨鋅含量均高于氟中毒組（P＜0.01或P＜0.05），而骨氟和骨磷含量均低于氟中毒組（P＜0.01或P＜0.05）。

3 討論

在我國，地方性氟中毒地區(qū)分布范圍廣，潛在受累人數(shù)多，屬全身中毒性疾病，其典型病癥為以骨代謝紊亂為主的氟骨癥[15]。本次研究使用高氟自來水制備飲水型氟中毒小鼠，結(jié)果可見，氟中毒小鼠出現(xiàn)不同程度的氟斑牙，且骨組織中氟含量顯著增加，說明氟中毒模型制備成功。

表2 各組小鼠股骨骨礦含量Tab.2 Femoral bone mineral content of mice in each group ±s，n=8

表2 各組小鼠股骨骨礦含量Tab.2 Femoral bone mineral content of mice in each group ±s，n=8

注：氟中毒組與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；丁酸鈉組與氟中毒組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

分組對照組氟中毒組丁酸鈉組氟（μg/g）1 224.08±114.84 2 728.99±480.94**1 934.87±278.35##鈣（mg/g）177.15±46.24 132.81±26.06*160.39±18.42#磷（mmol/g）3.23±0.74 6.69±0.85**5.74±0.72#鎂（mg/g）4.60±1.05 1.79±0.61**2.83±0.67##鋅（μg/g）179.48±42.67 139.75±16.30*183.00±19.52##

已有研究[16-17]顯示，氟對骨組織的影響呈雙向病理變化，即在低劑量條件下氟可激活成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨作用；反之則抑制成骨過程。本次實驗觀察到，氟中毒小鼠骨鈣含量顯著降低，同時伴有鎂、鋅元素含量的降低及骨磷含量的增加，說明高氟條件下，實驗小鼠呈現(xiàn)骨礦代謝紊亂狀態(tài)[18-19]；此外，三維立體影像顯示，氟中毒小鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏、粗細(xì)不均，部分區(qū)域出現(xiàn)骨小梁斷裂和缺失，呈現(xiàn)明顯的骨微結(jié)構(gòu)破壞，同時骨CT參數(shù)變化也印證了上述骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞性改變，這與BIAN等[20-21]的研究結(jié)果相似。正因如此，生物力學(xué)測試結(jié)果就正好解釋了為什么氟中毒小鼠的骨結(jié)構(gòu)強度顯著降低。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸在調(diào)控骨代謝方面作用積極，并可作為骨質(zhì)疏松癥防治的有效干預(yù)措施之一。作為短鏈脂肪酸的重要成員，丁酸及其鹽類在增加骨量、改善骨微結(jié)構(gòu)和預(yù)防骨質(zhì)疏松等方面已得到動物實驗證實[26]。其可能機制：一是通過誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞代謝的重編程，或通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞間接抑制破骨細(xì)胞分化，減少破骨細(xì)胞數(shù)量，調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)；二是，經(jīng)由Wnt信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，減少骨質(zhì)流失，改善骨微結(jié)構(gòu)[24]；三是，激活細(xì)胞核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件信號通路，增強細(xì)胞抗氧化能力[25-26]。既然如此，本研究中丁酸鈉糾正氟中毒小鼠骨礦含量紊亂、修正骨小梁物理參數(shù)及改善骨微結(jié)構(gòu)等結(jié)果，均可能與上述骨代謝調(diào)節(jié)機制密不可分。還需指出的是，丁酸鈉能顯著降低氟中毒小鼠骨氟含量，這就提示，丁酸鈉通過干擾氟吸收或促進(jìn)氟代謝亦可能是其拮抗氟毒性的機制之一。

總之，丁酸鈉可以緩解氟中毒小鼠骨礦含量紊亂狀態(tài)，改善骨微結(jié)構(gòu)，增強骨結(jié)構(gòu)強度。