Seyitmammedov Eziz，張智*，蔣士龍，解慶剛

(1.東北林業(yè)大學林學院，哈爾濱150000；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江齊齊哈爾161000)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)是菊科(Asteraceae)多年生草本植物，是我國常見的藥食兩用植物，在世界范圍內廣泛分布[1-3]。據統(tǒng)計，中國有70種蒲公英，其中藥用蒲公英27種，最常見的是生長在內蒙古、東北等地的6種蒲公英[4]。蒲公英含有黃酮類、酚類、生物堿、萜類等多種生物活性成分，具有保護肝臟、利尿、抗癌、抗炎和抗氧化等特性[5-6]。蒲公英及其提取物，天然安全有效，廣泛用于治療肝臟疾病、胃腸道疾病、骨關節(jié)炎、癌癥、眼病等疾病[7]。

研究表明，微生物發(fā)酵可以提高植物中生物活性物質提取率[8-10]。微生物可以分解植物細胞中的纖維素、木質素等大分子物質，破壞植物細胞壁結構，從而更有效地提取植物中的活性物質，提高生物利用度[11]。固體發(fā)酵是蒲公英的增值和利用的一種獨特工藝方法，與液態(tài)發(fā)酵相比固態(tài)發(fā)酵具有成本低、產后續(xù)處理簡單和產率高等優(yōu)勢。目前，微生物發(fā)酵技術已被廣泛應用于植物中活性物質的提取，而利用固態(tài)發(fā)酵法提取蒲公英中黃酮類化合物研究報道較少。

黃酮類化合物是一大類植物次生代謝產物，具有清除自由基和參與抗氧化反應的能力，具有較強的抗氧化活性[12-13]，可用于治療人體免受慢性疾病[14]和炎癥性疾病[15]。研究蒲公英經固態(tài)發(fā)酵處理后，黃酮類化合物的含量及抗氧化活性的變化，為固態(tài)發(fā)酵蒲公英的開發(fā)利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒲公英,市售；益生菌制劑,東北林業(yè)大學食品發(fā)酵實驗室保藏；1，2-二苯基代苦味肼基自由基(DPPH)Sigma公司；硫酸、苯酚、95% 乙醇、瓊脂、MRS 液體培養(yǎng)基成分等試劑，均為分析純。

立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺,蘇凈集團安泰公司；GL-20B型全自動高速冷凍離心機,湘西儀器儀表總廠機械儀器廠；上海精密科學儀器廠；PHS-3C型精密pH計 上海恒磁電子科技有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng)

1.2.1.1 菌種活化:將斜面保存的益生菌制劑接種到種子培養(yǎng)基(MRS液體培養(yǎng)基)中，120 r/min，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，重復活化 2 次，備用。

1.2.1.2 菌懸液的制備:將活化的益生菌制劑，以1%的量再次接種入滅菌后 MRS 液體培養(yǎng)基中，使益生菌制劑處于對數(shù)生長期后期，然后分裝于50 mL無菌離心管中，4 ℃離心(10000 r/min，10 min)，棄去上清液。將益生菌制劑細胞稱重后按照1∶1的比例加入滅菌生理鹽水(0.9%的濃度)，振蕩混勻后，制成益生菌制劑的菌懸液。

1.2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng):將益生菌制劑菌懸液按10%接種量接種至蒲公英粉末中，含水比為1∶3，35 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 碳源種類對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按10%接種量接種至蒲公英粉末中，含水比為1∶3，分別加入2.5%的蔗糖、葡萄糖、乳糖，在35 ℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.2 蔗糖添加量對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按10%接種量接種至蒲公英粉末中，在含水比為1∶3，發(fā)酵溫度35 ℃的條件下，分別加入0、2.5%、5%、7.5%、10%的蔗糖，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.3 含水比對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按10%接種量接種至蒲公英粉末中，加入2.5%的蔗糖，在含水比分別為1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1:4的條件下，在35 ℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.4 接菌量對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液分別按10%、15%、20%、25%、30%接種量接種至蒲公英粉末中，加入2.5%的蔗糖，在含水比為1∶2.5條件下，在35 ℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.5 發(fā)酵溫度對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按25%接種量接種至蒲公英粉末中，加入2.5%的蔗糖，在含水比分別1∶2.5，發(fā)酵溫度分別為32、35、37、40、43℃的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分別測定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.2.6 發(fā)酵時間對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響：將益生菌制劑菌懸液按25%接種量接種至蒲公英粉末中，加入2.5%的蔗糖，在含水比分別1∶2.5，在35 ℃條件下，分別發(fā)酵培養(yǎng)12、18、24、30、36 h的條件下。分別測定發(fā)酵液中活菌數(shù)。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用 Box-Behnken(BBD)中心組合設計原理，選擇接菌量(A)、發(fā)酵時間(B)、發(fā)酵溫度(C)、含水比(D)為自變量，以活菌數(shù)為響應值，設計四三因素三水平響應面優(yōu)化試驗。因素水平設計表 1。

表1 響應面因素水平表

1.2.4 DPPH 自由基清除率[16]

采用95%的乙醇溶液DPPH粉末，配制成0.2 mmol/L的溶液。取樣液2 mL與2 mL的DPPH溶液混合搖勻，室溫下避光放置30 min后，于517 nm下測吸光值，記為A樣品；用95%的乙醇代替DPPH溶液，同樣條件下室溫避光放置30 min后，于517 nm下測吸光值，記為A空白；管以95%的乙醇代替樣品，于517nm下測吸光值，記為A對照。

式中：A樣品為樣液加DPPH的吸光度值；A對照為樣液加乙醇溶液的吸光度值；A空白為DPPH加乙醇溶液的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 碳源種類對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

碳源是微生物發(fā)酵過程中重要的營養(yǎng)成分之一，蔗糖、葡萄糖、乳糖是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中常用的碳源[17]。乳酸菌代謝的糖類的種類和數(shù)量不同，其產酸量也不同，蒲公英中低聚糖含量較少，不利于益生菌制劑生長與產酸，所以需要補充一定的碳源。如圖1所示。在蒲公英固態(tài)發(fā)酵過程中添加2.5%蔗糖，更有利益于益生菌制劑的生長。

圖1 碳源對固態(tài)發(fā)酵過程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.2 蔗糖添加量對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

蔗糖作為乳酸菌發(fā)酵的有效碳源，可以促進益生菌。由圖2可知，發(fā)酵液中的活菌數(shù)，呈先增加后下降的趨勢。在蔗糖添加量在2.5%時，發(fā)酵液中活菌數(shù)含量最高。因此選取2.5%為單因素中蔗糖最佳添加量。

圖2 蔗糖添加量對固態(tài)發(fā)酵過程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.3 料水比對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

由圖3可知，發(fā)酵液中的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在培養(yǎng)基含水比例為1∶2.5時活菌數(shù)含量最高，此后有所降低。原因可能是在固體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基含水量過低，不能滿足其生長繁殖的需要，而含水量高導致培養(yǎng)基中溶解氧不足，影響新陳代謝[18]。因此選取1∶2.5為單因素中最佳培養(yǎng)基最佳水料比。

圖3 料水比對固態(tài)發(fā)酵過程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.4 接菌量對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

由圖4可知，當蒲公英固態(tài)發(fā)酵的接菌量在10%～25%，發(fā)酵液活菌數(shù)隨著接菌量的增加而增加，接種量為25%時活菌數(shù)最高，接種量大于25%時活菌數(shù)開始下降。接菌量濃度低時，活菌數(shù)少，發(fā)酵緩慢。當接菌量過大，抑制了菌體生長，導致活菌數(shù)降低。因此選取接菌量為25%，為單因素中最佳培養(yǎng)基最佳接菌量。

圖4 接菌量對固態(tài)發(fā)酵過程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.5 發(fā)酵時間對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

由圖5可知，隨著蒲公英固態(tài)發(fā)酵的進行，在12～24 h時發(fā)酵液中的活菌數(shù)不斷增加，在24 h增長達到了最高點，活菌數(shù)為3.25×108cfu/mL，發(fā)酵時間超過24 h后，活菌數(shù)顯著下降。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵底物中碳源等營養(yǎng)物質的減少影響了益生菌制劑的生長。因此選取發(fā)酵時間24 h，為單因素中最佳培養(yǎng)基最佳發(fā)酵時間。

圖5 發(fā)酵時間對固態(tài)發(fā)酵過程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.6 發(fā)酵溫度對固態(tài)發(fā)酵蒲公英的影響

由圖5可知，當發(fā)酵溫度在32～37 ℃時，發(fā)酵液中的活菌數(shù)隨著溫度的增加不斷增加，在37 ℃時，增長達到了最高點，活菌數(shù)為3.2×108cfu/mL，發(fā)酵溫度超過37 ℃后，隨著發(fā)酵溫度的上升，活菌數(shù)顯著下降。因此選取發(fā)酵溫度為37 ℃，為單因素中最佳培養(yǎng)基最佳發(fā)酵溫度。

圖6 發(fā)酵溫度對固態(tài)發(fā)酵過程中益生菌制劑活菌數(shù)的影響

2.7 蒲公英固態(tài)發(fā)酵響應面實驗及其優(yōu)化

采用響應面法優(yōu)化提高蒲公英固態(tài)發(fā)酵活菌數(shù)，按照表1的設計方案利用Design-Expert 8.0.5設計Box-Behnken實驗及其測定結果如表2所示。

表2 Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗設計及結果

續(xù)表2

對表2中的發(fā)酵蒲公英活菌數(shù)試驗數(shù)據進行多元回歸擬合，獲得發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接菌量、含水量對蒲公英固態(tài)發(fā)酵DPPH清除率的二次回歸方程模型為：

Y=+3.5-0.055A+0.049B+0.10C-0.041D-0.15AB-0.19AC+0.048AD+0.050BC+0.098BD-0.12CD-0.63A2-0.46B2-0.59CC-0.57D2

表3 回歸模型方差分析結果

續(xù)表3

根據回歸方程，做出響應面圖形，分析各因素間的交互作用。圖7為接菌量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、料水比對蒲公英固態(tài)發(fā)酵產物DPPH清除率影響的3D曲面圖和等高線圖。3D曲面開口向下，傾斜程度大，等高線為橢圓形，表明兩個因素之間交互作用顯著，表明四個因素的交互作用影響顯著，并且存在一個最優(yōu)值。響應面優(yōu)化模型預測結果：接菌量為24.48%，發(fā)酵時間為24.61 h，發(fā)酵溫度為37.95 ℃，含水1∶2.56，為操作方便將最優(yōu)條件修正為接菌量24%，發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度38 ℃，料水比1∶2.6。

圖7 各因素間交互作用的響應曲面圖

2.8 驗證性試驗

蒲公英固態(tài)發(fā)酵產物活菌數(shù)的理論值為3.16×109cfu/mL，DPPH清除率理論值為91.59%。在響應面優(yōu)化獲得的最佳發(fā)酵條件下，進行三次驗證試驗，活菌數(shù)的實際結果為2.98×109cfu/mL，此時DPPH為清除率90.7%，與理論值分別相差6%、0.9%，說明此模型可靠。

2.9 蒲公英固態(tài)發(fā)酵前后生物活性物質含量變化

微生物發(fā)酵能夠破壞植物細胞壁結構，有效促進黃酮類化合物的釋放[19-20]。如圖8所示，益生菌制劑發(fā)酵對蒲公英黃酮含量有顯著提高(P<0.05)，發(fā)酵后蒲公英黃酮含量達98.70 mg/g，是發(fā)酵前蒲公英黃酮含量(35.96 mg/g)的2.74倍，說明經過益生菌制劑發(fā)酵可以顯著提高蒲公英黃酮含量。

圖8 蒲公英固態(tài)發(fā)酵前后中黃酮含量變化

3 討論

近年來，微生物發(fā)酵被廣泛應用于提高植物中生物活性物質產量，通過發(fā)酵過程中產生的各種酶，包括脂肪酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶和淀粉酶，促進從底物中釋放或合成生物活性化合物[21-22]。目前，大多數(shù)益生菌產品都是液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵過程中會產生大量廢水，需要收集細菌，且操作復雜。相對于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵環(huán)境中水活度低，微生物易于生長，酶活度高，酶系統(tǒng)豐富。微生物的固態(tài)發(fā)酵受多種因素的影響，如接種量、溫度、時間、含水量等[23]。因此，本文采用益生菌制劑對蒲公英進行固態(tài)發(fā)酵，通過響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件，最大限度地提高蒲公英中黃酮類化合物的含量和抗氧化活性。

微生物在生長代謝過程中氮源用于菌體蛋白及核酸的合成，碳源用于為微生物生長提供能源物質[24-25]。在固態(tài)發(fā)酵過程中，添加適宜的氮、碳源的能促進菌體快速生長并提高產物的合成速度。本文通過單因素試驗對微生物發(fā)酵常用碳源進行篩選，發(fā)現(xiàn)添加2.5%的葡萄糖，更有利于益生菌制劑的生長，此條件下發(fā)酵產物中的活菌數(shù)含量最高。通過響應面試驗，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量24%、接種量24%，發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度38 ℃，料水比1∶2.6。在此條件下活菌數(shù)為2.98×109cfu/mL，此時DPPH為清除率90.7%，比優(yōu)化前提高1.28倍。

黃酮類化合物是一大類植物次生代謝產物[26]，是人類和動物飲食中不可或缺的一部分，具有清除自由基和參與抗氧化反應的能力[27-29]。試驗發(fā)現(xiàn)，蒲公英經過固態(tài)發(fā)酵后，具有更強的抗氧化活性，DPPH自由基清除率較未發(fā)酵蒲公英，提高了2.74倍。研究表明，微生物發(fā)酵會提高黃酮產量及抗氧化活性。郝紅梅等[30]采用酵母菌發(fā)酵黃芪藥材，黃酮產率與未發(fā)酵組比較提高了18%。閻欲曉等[31]利用米曲霉和黑曲霉進行混合菌種固態(tài)發(fā)酵甘蔗葉，測定發(fā)酵甘蔗葉中黃酮和多酚質量分數(shù)比未發(fā)酵甘蔗葉提高了50.72%和50.62%，并且抗氧化活性得到提高。

4 結論

通過單因素試驗、響應面優(yōu)化，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：蔗糖添加量2.5%、接種量24%、接種量24%，發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度38 ℃，料水比1∶2.6。在此條件下活菌數(shù)為2.98×109cfu/mL，此時DPPH為清除率90.7%，比優(yōu)化前提高1.28倍。經過益生菌制劑發(fā)酵后，蒲公英黃酮含量較未發(fā)酵蒲公英提高了2.74倍，試驗為固態(tài)發(fā)酵工藝對蒲公英開發(fā)利用提供了一定理論依據。