章金宇 賈紹強 郭 莉 劉 燕 琚童霞 余思宜 楊蘇成

(云南白藥集團股份有限公司 中國 云南 昆明 650200)

BioFirst實時微生物雙溫快速檢測系統(tǒng)是一款使用制備好的即用型檢測管和基于Windows的分析軟件控制的快速檢測微生物代謝活動的可控溫光學(xué)檢測系統(tǒng)。其原理是基于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)理論、最新的二氧化碳傳感技術(shù)及染色技術(shù)、新光源和光傳感器來完成對微生物的檢測。目標(biāo)微生物在檢測管中培養(yǎng)基的生長和測定可通過感光試劑進行檢測(色彩和熒光染色)。當(dāng)代謝過程發(fā)生時，該試劑的光譜模式發(fā)生改變，光傳感器檢測到這些變化，以預(yù)先設(shè)定好的時間間隔進行監(jiān)控[1]。

對口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料進行微生物檢驗，可以防止使用被微生物污染的原料進行生產(chǎn)，有效避免造成更大的損失，確保產(chǎn)品的微生物質(zhì)量符合國家、市場以及公司內(nèi)控標(biāo)準的要求。隨著新技術(shù)新方法的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了較多新型、先進、簡便的微生物快速檢測技術(shù)，可以明顯縮短微生物檢測的時間[2～4]?？谇蛔o理產(chǎn)品原料和化妝品原料面臨用量大，周轉(zhuǎn)要求快，時間緊的局面，引入準確、快速的檢測手段, 在保證檢驗結(jié)果準確可靠的前提下，有效縮短口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料微生物檢驗時間，滿足快速精準放行需求，提高原料使用周轉(zhuǎn)效率，有效減少倉儲使用面積，提高資金的使用效率。本實驗針對五種不同類型的口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料，采用BioFirst實時雙溫微生物快速檢測系統(tǒng)與《2015版化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[5]對原料中的菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌進行平行實驗，并對其有效性進行評估。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

BioFirst實時微生物雙溫快速檢測系統(tǒng)(圖1)，菌落總數(shù)檢測管，霉菌和酵母菌數(shù)檢測管，耐熱大腸菌群檢測管，銅綠假單胞菌檢測管，銅綠假單胞菌添加劑，金黃色葡萄球菌檢測管，金黃色葡萄球菌添加劑，均為上海美凱純生物科技有限公司；培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，電子天平，高壓蒸汽滅菌器，冰箱，生化培養(yǎng)箱，生物安全柜，定量菌種，渦旋振蕩器，移液器等。

圖1 BioFirst實時雙溫微生物快速檢測系統(tǒng)

1.2 實驗樣品

二氧化硅、維生素E乙酸酯、山梨醇、月桂醇聚醚硫酸銨(AESA)、蛇床子提取物。

1.3 菌種選擇

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希氏菌[CMCC(B)44102)、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉(ATCC16404)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)，均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司定量菌種。

2 實驗方法和結(jié)果

2.1 菌懸液的制備

2.1.1 菌落總數(shù)菌懸液制備：按照定量菌株說明書制備大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌混合液濃度約10-102CFU/mL和102-103CFU/mL的菌懸液。

2.1.2 霉菌和酵母菌菌懸液制備：按照定量菌株說明書制備黑曲霉和白色念珠菌混合液濃度約為10-102CFU/mL和102-103CFU/mL的菌懸液。

2.1.3 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌菌懸液制備：按照定量菌株說明書分別制備銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌濃度約1-10CFU/mL的菌懸液。

2.2 樣品稀釋液的制備

2.2.1 二氧化硅、山梨醇、月桂醇聚醚硫酸銨(AESA)、蛇床子提取物：稱取樣品10g，加到裝有玻璃珠及90ml滅菌生理鹽水的樣品瓶中,充分振蕩混勻，靜置15min。用其上清液作為1∶10的稀釋液。

2.2.2 維生素E乙酸酯：稱取樣品10g，加入70g滅菌生理鹽水, 再分別加入10ml滅菌液體石蠟和10ml滅菌吐溫80，置勻漿杯中,10000-20000轉(zhuǎn)勻漿1-3分鐘使成1∶10的稀釋液。

2.3 菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)實驗方法

2.3.1 BioFirst限定值檢測法介紹：BioFirst實時微生物雙溫快速檢測系統(tǒng)能夠檢測檢測管中一個活的細菌或者霉菌酵母菌。基于此原理，將樣品按產(chǎn)品放行的限量選擇合適的稀釋度稀釋后接種到BioFirst檢測管中，根據(jù)檢測管的陽性變化來判斷原始樣品是否合格的檢測方法稱為限定值檢測法。限量值法結(jié)果判讀：如果按照限量稀釋，在機器運行過程出現(xiàn)DT(檢測時間)，則表明樣品中的菌含量大于限定值；儀器未檢出(無DT)，則表明樣品中菌含量小于限定值。

2.3.2 取1∶10的稀釋液(2.2制備)按樣品限量值(企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準)做進一步稀釋；

2.3.3 菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)加菌及檢測：將樣品稀釋液分裝到空試管中，每個試管中分裝9mL樣品稀釋液，再分別加入1mL10～102CFU/mL和102～103CFU/mL的菌落總數(shù)菌懸液、霉菌和酵母菌菌懸液(2.1中制備)，使樣品稀釋液菌的最終濃度為1～10CFU/mL和10～100CFU/mL；再從10～102CFU/mL和102～103CFU/mL的菌懸液中取1mL加入到9ml生理鹽水管中制成濃度為1～10CFU/mL和10～100CFU/mL的純菌液；將未加菌樣品稀釋液、加菌樣品稀釋液和純菌液分別混合均勻后，分別取1mL加入菌落總數(shù)檢測管、霉菌和酵母菌數(shù)檢測管內(nèi)，菌落總數(shù)檢測管37℃上機檢測，霉菌和酵母菌數(shù)檢測管28℃上機檢測；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法同步進行檢測，以9mL的滅菌生理鹽水為陰性對照。實驗結(jié)果見圖1、圖2及表1。

圖2 維生素E乙酸酯霉菌和酵母菌快速檢驗檢測數(shù)據(jù)及曲線

圖3 AESA菌落總數(shù)快速檢驗檢測數(shù)據(jù)及曲線

表1 菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)實驗結(jié)果，截取部分快速檢驗檢測數(shù)據(jù)及曲線

2.4 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、耐熱大腸菌群實驗方法

2.4.1 BioFirst有和無定性檢測法：對于要求包括致病菌在內(nèi)的一些微生物不得檢出的樣品，需要進行定性檢測。即先將樣品在適合的培養(yǎng)基中進行前増菌，然后將增菌液樣品接種到特異性的BioFirst檢測管中，根據(jù)檢測管的陰陽性變化來判斷樣品中是否存在有目標(biāo)微生物。結(jié)果報告：機器運行過程中，如果出現(xiàn)DT檢測時間，則進行陽性確認；儀器未檢出(無DT)，則報告為陰性。

2.4.2 耐熱大腸菌群加菌及檢測：分別取1∶10的稀釋液(2.2制備)10mL加至兩瓶90mL的乳糖膽鹽增菌培養(yǎng)基，其中一瓶加入濃度為1～10CFU/mL的耐熱大腸菌群菌懸液1mL，兩瓶于44.5℃下增菌18～24h。混合均勻后每瓶取1mL分別加入到耐熱大腸菌群檢測管內(nèi)，45℃上機檢測；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法同步進行檢測，以10mL的滅菌生理鹽水為陰性對照，實驗結(jié)果見表2。

2.4.3 銅綠假單胞菌加菌及檢測：分別取1∶10的稀釋液(2.2制備)10mL加至兩瓶90mL的SCDLP液體培養(yǎng)基中，其中一瓶加入濃度為1～10CFU/mL的銅綠假單胞菌懸液1mL，兩瓶于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h?；旌暇鶆蚝笕∶科繅埦蟮臉右?.1mL分別加入到銅綠假單胞菌檢測管，另加0.1mL銅綠假單胞菌添加劑，混勻后上機37℃檢測；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法同步進行檢測，以10mL的滅菌生理鹽水為陰性對照，實驗結(jié)果見圖4、圖5及表2。

圖4 維生素E乙酸酯銅綠假單胞菌快速檢驗檢測數(shù)據(jù)及曲線

圖5 AESA耐熱大腸菌群快速檢驗檢測數(shù)據(jù)及曲線

2.4.4 金黃色葡萄球菌加菌及檢測：分別取1∶10的稀釋液(2.2制備)10mL加至90mL的SCDLP液體培養(yǎng)基中，其中一瓶加入濃度為1～10CFU/mL的金黃色葡萄球菌懸液1mL，兩瓶于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h?；旌暇鶆蚝笕∶科繅埦蟮臉右?.5mL分別加入到金黃色葡萄球菌檢測管，另加0.2mL金黃色葡萄球菌添加劑，混勻后上機37℃檢測；2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法同步進行檢測，以10mL的滅菌生理鹽水為陰性對照，實驗結(jié)果見表2。

表2 耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌實驗結(jié)果，截取部分快速檢驗檢測數(shù)據(jù)及曲線

3 結(jié)論

從BioFirst實時微生物雙溫快速檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果和2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法的檢測結(jié)果得出，5種口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料中的菌落總數(shù)、霉菌酵母菌、耐熱大腸菌群、金葡菌和銅綠假單胞菌含量均符合微生物標(biāo)準。在加菌樣品中，快速檢測系統(tǒng)對菌落總數(shù)和霉菌酵母菌的個位數(shù)的菌均能檢出，菌落總數(shù)中對個位數(shù)菌的檢出時間在12個小時左右，對十位數(shù)菌的檢出時間在10小時左右，對低至1個的霉菌酵母菌能夠在40小時左右檢出，對十位數(shù)的霉菌酵母菌的檢出時間約為25小時。對加到樣品中極少的(每g樣品中添加0～10個菌)耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均能夠檢出，增菌后的樣品能夠在3小時內(nèi)快速檢出，在10小時內(nèi)完全確定陰性結(jié)果。

2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》對微生物的檢測方法中，對菌落總數(shù)的檢測需要2天，霉菌和酵母菌數(shù)的檢測需要5天，耐熱大腸菌群和銅綠假單胞菌的檢測需要2～3天，金黃色葡萄球菌的檢測需要約3～5天。BioFirst實時微生物雙溫快速檢測系統(tǒng)能夠在18小時內(nèi)完全確定樣品中菌落總數(shù)的陰性結(jié)果，在48小時內(nèi)確定霉菌酵母菌的陰性結(jié)果，在30小時內(nèi)確定耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的陰性結(jié)果，與2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》微生物檢測法相比大大減少檢測時間。實驗證明，BioFirst實時微生物雙溫快速檢測系統(tǒng)檢測準確、快速、與2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》結(jié)果基本一致。對于化妝品原料中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢測項目的適用性良好，能夠作為口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料快速檢測和放行的可靠方法，有利于口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料在獲得準確檢測結(jié)果下的快速放行和質(zhì)量管理人員的科學(xué)決策。

2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》方法與BioFirst實時微生物雙溫快速檢測系統(tǒng)方法確定陰性檢驗時間對比如圖6。

圖6

因為口腔護理產(chǎn)品原料和化妝品原料很多，每個原料的性質(zhì)和微生物的限量都不一樣，對微生物的影響也都有不同。而現(xiàn)在的實驗過程中，因為檢測項目和檢測內(nèi)容過多，所以后續(xù)還需要繼續(xù)進行實驗，從而將各種原料的限定菌量和檢測時間對應(yīng)起來，從而確定各原料具體的陰性確定時間，有利于原料的精準放行，快速使用。

參考文獻(略)