王宇蘊(yùn) 趙兵 馬麗婷 李蘭 鄧亞琴 徐智

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

目前，隨著中國(guó)人口的快速增長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)水平的提高，農(nóng)業(yè)廢棄物以每年5%-10%的速度上升［1］，年產(chǎn)量高達(dá)50億t［2］。其中秸稈年產(chǎn)量約9億t，未利用的約3億t［3］；畜禽糞污產(chǎn)量為38億t，其綜合利用率卻不到60%［4］；蔬菜廢棄物（尾菜）達(dá)到約5 億t，未利用比例超過(guò)90%。由于農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)量巨大，處理工藝一直是研究的重點(diǎn)，填埋和焚燒作為傳統(tǒng)處理工藝，在導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失的同時(shí)，對(duì)環(huán)境及人體健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響。堆肥由于其工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，投資及運(yùn)行費(fèi)用相對(duì)較低，逐漸發(fā)展完善成為農(nóng)業(yè)廢棄物處理的主要技術(shù)手 段［5-6］，微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌）是其發(fā)酵的核心，能夠?qū)⑥r(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化成為腐殖質(zhì)（HS）等高附加值產(chǎn)品［7-10］。

利用好氧堆肥，微生物可以將有機(jī)物料分解為CO2、熱量、生物質(zhì)及HS等［11-13］。農(nóng)業(yè)廢棄物因來(lái)源、氣候條件及產(chǎn)地等不同而性質(zhì)各異［14］，尤其秸稈類廢棄物因其高有機(jī)質(zhì)特性成為了堆肥理想物料［15］。雖然高半纖維素、纖維素和木質(zhì)素形成不易被微生物降解的復(fù)雜結(jié)構(gòu)［16］，但木質(zhì)纖維素的分解有利于堆肥過(guò)程的HS形成［17-18］。HS作為堆肥最重要的產(chǎn)物，在改良土壤的同時(shí)，也是評(píng)價(jià)好氧堆肥過(guò)程最重要的指標(biāo)之一［19］，其中堆肥腐殖化過(guò)程是HS大量聚合的關(guān)鍵時(shí)期［20］，主要發(fā)生在堆肥的降溫階段，真菌在此過(guò)程中起主導(dǎo)作用的同時(shí)，也可能是堆肥腐殖化過(guò)程木質(zhì)素分解和HS聚合的主要驅(qū)動(dòng)因子［21-23］。因此，研究堆肥腐殖化過(guò)程及微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化處理具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。

目前，大量研究者將木質(zhì)素類廢棄物利用好氧堆肥工藝進(jìn)行了堆肥化處理，研究堆肥過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替、關(guān)鍵酶活、前體物質(zhì)濃度變化等，并進(jìn)一步分析堆肥腐殖化進(jìn)程及微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制，提出今后堆肥腐殖化過(guò)程研究的重要方向，以期為促進(jìn)堆肥腐殖化過(guò)程，強(qiáng)化農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用提供科學(xué)參考。

1 堆肥腐殖化過(guò)程

堆肥腐殖化過(guò)程涉及一個(gè)復(fù)雜的微生物主導(dǎo)的生物和生化過(guò)程，其中腐殖酸的形成過(guò)程被稱之為腐殖化。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，堆肥腐殖化是由一系列不同微生物同時(shí)作用以降解有機(jī)物產(chǎn)生腐殖酸為目的，其中酶催化是堆肥過(guò)程中的驅(qū)動(dòng)因素［24］。在好氧堆肥過(guò)程中，升溫和高溫階段中嗜熱微生物占主導(dǎo)地位，首先將纖維素和半纖維素分解形成碳水化合物，在降溫期和腐熟階段，隨著纖維素和半纖維素含量的減少，木質(zhì)素開始被嗜溫性微生物（真菌）通過(guò)分泌木質(zhì)素酶的形式分解形成酚和醌等物質(zhì)，然后形成HA［25-28］，因此木質(zhì)素被稱之為HS形成的原料和骨架。此外，由于HS通常由難以彼此分離的不同分子組成，因此很難完全闡明其結(jié)構(gòu)，根據(jù)pH溶解度，HS可細(xì)分為富里酸（FA）、腐殖酸（HA）和胡敏素（HM）。根據(jù)含氧官能團(tuán)的大小順序?yàn)镕A、HA和HS，而聚合物結(jié)構(gòu)的大小順序則相 反［29-30］。分子量較高的HA具有更多的芳香碳，分子量較低的FA則具有更多的脂肪族碳和羧基［31-32］，堆肥腐殖化過(guò)程是一個(gè)FA含量降低，HA含量升高的過(guò)程，在此過(guò)程中木質(zhì)纖維素的降解有助于HA的形成［27，33］，其中降解酶扮演著重要的角色。

1.1 木質(zhì)素的降解

木質(zhì)素作為一種可再生的天然芳香族高分子聚合物，主要由苯丙烷醇及其衍生物通過(guò)醚鍵和碳鍵連接而形成聚酚類三維網(wǎng)狀高分子化合物，因其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)難以被微生物降解［34］。真菌作為降解木質(zhì)素最有力的微生物，因?qū)囟忍厥獾南埠?，在好氧堆肥過(guò)程中大量存在于冷卻及腐熟期，此外由于木質(zhì)素在升溫期和高溫階段不能完全被分解，因此降溫階段木質(zhì)素的降解對(duì)腐殖化進(jìn)程顯得尤為重要。

真菌對(duì)木質(zhì)素的降解主要通過(guò)其分泌的木質(zhì)素酶來(lái)起作用，包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）、錳過(guò)氧化物酶（MnP）、漆酶（Lac）等。LiP能夠催化堆肥過(guò)程中各種芳香族有機(jī)化合物酚（愈瘡木酚、香草酸醇、兒茶酚、丁香酸）和非酚性木質(zhì)素的分解［35］，形成苯氧自由基等，這些自由基通過(guò)與酚類化合物聚合、側(cè)鏈裂解、去甲基化、C-C裂解和芳香環(huán)開環(huán)的偶聯(lián)反應(yīng)，催化木質(zhì)素中的非酚類芳香底物和β-o-4醚鍵和Cα-Cβ鍵的裂解［36］，LiP主要由擔(dān)子菌和子囊菌門等真菌（白腐菌、褐腐菌）分泌［37］。MnP和LiP不僅表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，因具有較高的氧化還原電位，對(duì)木質(zhì)素具有獨(dú)特降解作用。MnP由Mn2+和血紅素基構(gòu)成活性中心，Mn2+的作用是傳遞電子，H2O2作為電子受體，接受Mn2+的一個(gè)電子，Mn3+與草酸鹽和乙酸鹽等小分子鰲合，從而促進(jìn)木質(zhì)素被氧化，然后去甲基化，烷基苯基鍵斷裂，Cα-Cβ鍵斷裂最終實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素降解［35，37-38］。MnP大多來(lái)自擔(dān)子菌門中的P. chrysosporium、P. radiata 和 Rigidoporus lignosus，此外，在白腐菌中MnP的表達(dá)比LiP更普遍［39］。Lac作為一種含銅的多酚氧化酶，是一種糖基化蛋白質(zhì)，可以通過(guò)氧化各種底物，包括酚類、芳胺類、苯胺類、硫醇類和木質(zhì)素，將分子氧的電子還原成兩個(gè)水分子。此外，Lac的氧化反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致自由基的形成，自由基作為酶的中間底物，能夠與具有高氧化還原電位的各種底物相互作用，從而增強(qiáng)解聚反應(yīng)，初始自由基通常是不穩(wěn)定的，并在酚類化合物氧化系統(tǒng)中從酚轉(zhuǎn)化為醌，對(duì)HS的形成起重要作用［35］。主要存在于Trametes versicolor、P. placenta、H. jecorin和Xylaria sp.等 真菌中。真菌能氧化酚類化合物，生成苯氧自由基和醌類化合物，與軟腐菌相比，白腐菌和褐腐菌的木質(zhì)素降解率較高［40］。在好氧堆肥腐殖化過(guò)程中，木質(zhì)素降解以后以酚、醛等前體形式與蛋白質(zhì)進(jìn)行縮合形成腐殖質(zhì)。

1.2 HS前體物質(zhì)的形成

在好氧堆肥腐殖化過(guò)程中，來(lái)源廣泛的有機(jī)成分被微生物降解為小分子產(chǎn)物，小分子產(chǎn)物可通過(guò)微生物細(xì)胞內(nèi)代謝生成中間體作為HS形成重要的前體物質(zhì)，這些前體物質(zhì)通過(guò)特定途徑聚合形成HS［41］，此外關(guān)于腐殖化過(guò)程中HS形成的美拉德反應(yīng)、木質(zhì)素-蛋白質(zhì)理論和多酚-蛋白縮合理論等都一定程度上強(qiáng)調(diào)了前體相互作用對(duì)HS形成的重要性［42］，因此在腐殖化過(guò)程中前體物質(zhì)對(duì)HS的形成具有重要的作用。

在好氧堆肥過(guò)程中，HS前體的形成來(lái)源于微生物對(duì)木質(zhì)纖維素的分解，前體物質(zhì)的產(chǎn)生主要發(fā)生在升溫和高溫階段，而HS的聚合則主要發(fā)生在降溫和腐熟階段［25］。前體的形成可分為分解和合成兩個(gè)部分，大部分有機(jī)物首先被微生物分解，然后通過(guò)低分子量化合物（如多酚、羧基和氨基酸等）的生化途徑形成HS前體，隨后前體物質(zhì)形成 HS［26-28］。研究發(fā)現(xiàn)，由不同類型多糖組成的纖維素和半纖維素能夠被微生物分解為單糖等，而作為聚酚類三維網(wǎng)狀高分子化合物的木質(zhì)素則能夠被微生物轉(zhuǎn)化為更小的芳香物質(zhì)，這些較小的分子物質(zhì)一部分可以被微生物用作營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另一部分形成醌類、芳香醛類、醇類、開環(huán)產(chǎn)物、多酚或酚類衍生物（羥基醌與氨基酸）等前體物質(zhì)，進(jìn)一步形成 HS［41，43-44］。主要作用機(jī)理是木質(zhì)素分解產(chǎn)生的多酚或酚類衍生物與氨基酸等蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，一部分首先形成腐殖酸分子核心，另一部分通過(guò)聚合形成FA，F(xiàn)A再進(jìn)一步縮合形成HA，最后形成HS，進(jìn)一步說(shuō)明木質(zhì)素及其降解產(chǎn)物對(duì)腐殖化進(jìn)程的重要作用［45］。

1.3 堆肥腐殖質(zhì)形成的主要影響因素

在堆肥腐殖化過(guò)程中，木質(zhì)素的降解與微生物的代謝和降解酶離不開關(guān)系，然而由于微生物在不同的代謝環(huán)境中，具有不同的適應(yīng)性，適宜的環(huán)境能夠激發(fā)真菌豐度，提高關(guān)鍵酶活性來(lái)深化木質(zhì)素降解，強(qiáng)化堆肥腐殖化進(jìn)程，其中溫度、pH等環(huán)境因素是影響腐殖化進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)境因子［41，46-50］。

HS作為堆肥的主要產(chǎn)物，其芳香部分被認(rèn)為來(lái)自木質(zhì)素，而木質(zhì)素難以降解的特性使得其在高溫期不能完全被分解，真菌對(duì)木質(zhì)素的降解效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌和放線菌，并且高溫期的溫度不能滿足真菌菌群的有效生長(zhǎng)，此外，木質(zhì)素降解酶最佳活性和對(duì)木質(zhì)素最大降解速率所適宜的溫度均不能超過(guò)45℃，說(shuō)明溫度對(duì)腐殖化進(jìn)程的重要性。堆肥是一個(gè)趨堿的過(guò)程［51］，且大部分降解酶所適宜的pH為中性偏酸［38，40］，此外堆肥pH值的高低也會(huì)影響微生物的活性以及代謝，一些真菌不能抵抗極端環(huán)境條件（高溫和pH）。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)堆肥初始pH值對(duì)堆肥過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響［52］，在堆肥過(guò)程中所涉及的微生物都是在特定的pH范圍內(nèi)代謝并繁殖，其中細(xì)菌適宜pH 在6-7.5，大多數(shù)真菌喜歡酸性條件，并且一些真菌生長(zhǎng)環(huán)境pH值不宜超過(guò)7.5［11］，因此調(diào)節(jié)或控制腐殖化階段適宜的pH來(lái)提高微生物豐度及降解酶的活性，從而促進(jìn)堆肥腐殖化進(jìn)程可能是提高堆肥腐質(zhì)化進(jìn)程的重要途徑之一［52］。

2 堆肥腐殖化微生物（真菌）驅(qū)動(dòng)機(jī)制

真菌對(duì)于木質(zhì)素的降解能力顯著高于細(xì)菌和放線菌，由于高溫階段特殊的溫度環(huán)境抑制了真菌的繁殖與代謝，恰恰降溫階段的環(huán)境為真菌繁殖代謝提供了溫床，這就有助于進(jìn)一步深化木質(zhì)素分解，產(chǎn)生更多的前體物質(zhì)（氨基酸、糖類、酚類、羧酸等）以合成HA，結(jié)合HA在降溫及腐熟階段大量生成，因此，推測(cè)真菌群落的演替可能是HA合成的一個(gè)主要驅(qū)動(dòng)因素。微生物驅(qū)動(dòng)腐殖質(zhì)的形成與酶密切相關(guān)，雖然Lac能夠催化酚類化合物的單電子氧化成自由基中間體，這些中間體隨后可以通過(guò)共價(jià)鍵相互偶聯(lián)，加速腐殖化過(guò)程，從而參與HA的形成［53］。此外，也有研究通過(guò)在固體廢棄物堆肥中接種漆酶發(fā)現(xiàn)，腐殖化速率得到顯著提高［54］，但合成HA的具體機(jī)理機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)高木質(zhì)纖維素廢棄物堆肥腐殖化過(guò)程中真菌以子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為主［24，55-56］，其中子囊菌門中的木霉屬、曲霉屬和裸節(jié)菌屬，擔(dān)子菌門中的鬼傘屬和平革菌屬等真菌是堆肥腐殖化過(guò)程中的主要菌屬［24，57-59］。擔(dān)子菌門中的白腐真菌對(duì)木質(zhì)素的降解具有特殊的能力，接種白腐真菌可以促進(jìn)木質(zhì)纖維素的生物降解和HA的形成，從而促進(jìn)腐殖化過(guò)程［60］。P. chrysosporium作為擔(dān)子菌門的一種，對(duì)木質(zhì)素具有極強(qiáng)的降解作用，在降溫階段接種是保證P. chrysosporium活性的有效方法，其中在堆肥降溫期接種P. chrysosporium是促進(jìn)纖維素和木質(zhì)素降解，促進(jìn)堆肥腐殖化的重要手段［21，52，61-62］。Tortosa等［63］通過(guò)對(duì)橄欖廢棄物堆肥研究發(fā)現(xiàn)，真菌多樣性的增加以子囊菌們（Ascomycota）為主，此外堆肥過(guò)程中真菌豐度的增加，也進(jìn)一步證實(shí)了真菌在腐熟階段的重要作用，其中部分擔(dān)子菌在腐殖化過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，并且與腐殖化參數(shù)呈顯著正相關(guān)。

提高腐殖化過(guò)程中真菌群落的豐度，特別是增加子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是促進(jìn)腐殖化進(jìn)程的有效方法。在前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為HS的過(guò)程中，提高關(guān)鍵真菌的豐度，深化木質(zhì)素的降解以提高前體物質(zhì)對(duì)促進(jìn)堆肥腐質(zhì)化過(guò)程至關(guān)重要，這也是目前研究清楚的堆肥腐殖化微生物（真菌）驅(qū)動(dòng)機(jī)制。

3 結(jié)論與展望

本文綜述了堆肥腐殖化過(guò)程中木質(zhì)素酶降解機(jī)制及真菌的驅(qū)動(dòng)作用，在好氧堆肥中掌握腐殖化進(jìn)程中的微生物群落演替，是深化堆肥腐殖化進(jìn)程中木質(zhì)素降解，強(qiáng)化HS形成的關(guān)鍵步驟。木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)好氧堆肥過(guò)程中，在腐殖化階段以子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為主的真菌，包括木霉屬、曲霉屬、裸節(jié)菌屬，鬼傘屬和平革菌屬等通過(guò)大量分泌木質(zhì)纖維素關(guān)鍵降解酶（LiP、MnP和Lac等）進(jìn)一步深化木質(zhì)素的持續(xù)降解，以提高HS前體物質(zhì)的補(bǔ)充是強(qiáng)化堆肥腐殖化進(jìn)程的主要作用機(jī)理。但目前對(duì)堆肥腐殖化過(guò)程的腐殖質(zhì)合成途徑和關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子研究較少，探索堆肥過(guò)程中參與HS合成代謝途徑的關(guān)鍵基因和酶，鑒定功能微生物特性以提高微生物產(chǎn)酶能力，并確定微生物在堆肥過(guò)程中的具體功能和作用，以強(qiáng)化腐殖化進(jìn)程并提高堆肥產(chǎn)物HS含量，是今后堆肥腐殖化過(guò)程研究的重要方向。