張 蒙，王瑞芬，管雯斌，孫也淇，李凌軒，李俊磊，王立峰

胃癌是全球第五大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)EBV感染與胃癌有關(guān)。2014年癌癥基因組圖譜(TCGA)提出EBV相關(guān)性胃癌(EBV-associated gastric cancer, EBVaGC)是一種特殊的亞型，是免疫治療的主要受益群體[3]。EBVaGC是一組具有顯著臨床病理學(xué)特點(diǎn)及獨(dú)特基因改變的腫瘤。目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的EBVaGC較少。本文回顧性分析21例EBVaGC的臨床病理學(xué)特征，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)探討其治療及預(yù)后，以提高病理醫(yī)師對(duì)EBVaGC的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年4月～2021年8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院576例胃癌根治性手術(shù)標(biāo)本，由兩名資深病理醫(yī)師重新復(fù)閱切片。所有病例均行EBER原位雜交檢測(cè)，篩選出EBVaGC標(biāo)本21例。

1.2 方法

1.2.1HE及免疫組化 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm厚切片，行HE及免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法，DAB顯色，一抗包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、HER-2，購(gòu)自上海羅氏公司；PD-L1購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Claudin-18.2購(gòu)自北京中杉金橋公司。參照試劑盒說(shuō)明書操作，使用Leica全自動(dòng)染色機(jī)及羅氏公司Ventana Ultra全自動(dòng)免疫組化染色儀染色。

1.2.2EBER原位雜交 使用羅氏公司Ventana Ultra全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行EBER原位雜交。原位雜交蛋白酶、EBER探針、原位雜交藍(lán)染染液和紅色復(fù)染劑均為羅氏工作液。參照U INFORM iVIEW Blue ISH染色程序操作。在陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞核著色良好的情況下，腫瘤細(xì)胞核著色為深藍(lán)色記為陽(yáng)性，以平均視野>5%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性且排除正常黏膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)淋巴細(xì)胞陽(yáng)性，歸類為EBVaGC[4]。

1.2.3FISH檢測(cè) 對(duì)HER-2免疫組化2+者加做FISH檢測(cè)，探針購(gòu)自美國(guó)雅培公司，步驟參照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1錯(cuò)配修復(fù)蛋白(mismatch repair, MMR)免疫組化判讀標(biāo)準(zhǔn) 在內(nèi)對(duì)照(正常胃腺上皮及淋巴細(xì)胞等)細(xì)胞核著色良好的情況下，腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽(yáng)性；4個(gè)蛋白均陽(yáng)性為錯(cuò)配修復(fù)蛋白功能正常(mismatch repair-proficient, p-MMR)，至少一種蛋白陰性則判定為錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失(mismatch repair-deficient, d-MMR)。

1.3.2HER-2免疫組化判讀標(biāo)準(zhǔn) 0：無(wú)著色或<10%腫瘤細(xì)胞膜染色；1+：≥10%腫瘤細(xì)胞微弱或隱約可見膜染色，或僅有部分細(xì)胞膜染色；2+：≥10%腫瘤細(xì)胞有弱到中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色；3+：≥10%腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強(qiáng)染色。參考2016版胃癌HER-2檢測(cè)指南[5]，2+者須加做FISH檢測(cè)。

1.3.3Claudin-18.2免疫組化判讀標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)染色程度分為4級(jí)：無(wú)細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色為0分，弱細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色為1分，中等細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色為2分，強(qiáng)細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色為3分。以Claudin-18.2在≥40%腫瘤細(xì)胞染色程度≥2分定義為陽(yáng)性[6]。

1.3.4PD-L1免疫組化判讀標(biāo)準(zhǔn) 采用綜合陽(yáng)性評(píng)分(combined positive score, CPS)[7]，即CPS=(PD-L1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞+PD-L1陽(yáng)性腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100，CPS值≥1即為PD-L1陽(yáng)性，反之為陰性。

1.3.5FISH HER-2基因擴(kuò)增檢測(cè) 在100倍油鏡下觀察胃癌細(xì)胞核，計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值，Ratio值=50個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/50個(gè)細(xì)胞核中綠信號(hào)總數(shù)。Ratio值<1.8為陰性；>2.2為陽(yáng)性；1.8～2.2時(shí)，可以選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè)，或重做實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，一致性檢驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)χ2檢驗(yàn)及多個(gè)樣本率比較的χ2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征576例胃癌中檢出EBVaGC 21例，占同期胃癌的3.6%，其中男性17例(81.0%)，女性4例(19.0%)。發(fā)病年齡42～74歲，平均61歲，中位年齡62歲；位于近端胃13例(61.9%)，遠(yuǎn)端胃8例(38.1%)；腫瘤最大徑1.5～11 cm(表1)。

表1 EBV相關(guān)性胃癌21例臨床病理學(xué)特征

2.2 組織學(xué)特征7例(33.3%)腫瘤細(xì)胞彌漫片狀、小梁狀分布，細(xì)胞多角形、合胞樣，核空泡狀，核膜明顯，核分裂易見，間質(zhì)內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)；7例(33.3%)腫瘤細(xì)胞排列成腺管狀，細(xì)胞中等大小(圖2)；少數(shù)病例腫瘤細(xì)胞核被黏液推擠至一旁形成印戒細(xì)胞。Lauren分型：腸型7例(33.3%)，彌漫型4例(19.0%)，混合型2例(9.5%)，不能確定型8例(38.1%)。WHO分型：伴淋巴樣間質(zhì)的癌7例(33.3%)；其他非伴淋巴樣間質(zhì)的癌14例(66.7%)：包括管狀腺癌7例(33.3%)，低黏附性癌4例(19.0%)，混合性腺癌2例(9.5%)，未分化癌1例(4.8%)。

2.3 免疫表型及分子檢測(cè)21例EBER原位雜交均顯示腫瘤細(xì)胞核著色為深藍(lán)色(圖3、4)，其中5%

2.4 EBVaGC與non-EBVaGC臨床病理特點(diǎn)比較EBVaGC和non-EBVaGC在發(fā)病部位、組織學(xué)類型、Lauren分型、PD-L1 CPS評(píng)分、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。根據(jù)腫瘤細(xì)胞EBER陽(yáng)性百分比將EBVaGC劃分為5%0.05)。

2.5 治療與預(yù)后21例患者均接受胃癌根治術(shù)并進(jìn)行了D2淋巴結(jié)清掃，術(shù)后有8例患者行化療。2例失訪，5例死亡，14例生存，生存時(shí)間1.30～88.13個(gè)月。

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率僅次于肺癌和結(jié)腸癌[1,9]。自1990年Burke首次報(bào)道EBV陽(yáng)性胃癌以來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，部分胃癌的發(fā)生與EBV有關(guān)[10]。雖然EBV在成人中的感染率高達(dá)90%，但在胃癌中的感染率較低。2014年TCGA分子分型中EBVaGC約占9%，其發(fā)病率在各地區(qū)及人種之間有所不同，如北美白種人中EBVaGC發(fā)病率為16%，日本為7%；國(guó)內(nèi)報(bào)道吉林省約7.6%、安徽省4.1%、北京3.9%、山東省2.1%[11-12]。本組中EBVaGC僅占比3.6%，與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。目前，其地區(qū)及人種之間感染率差異的原因有待于進(jìn)一步探討[13]。

EBVaGC被定義為在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到EBV感染[14]，EBER原位雜交是診斷EBVaGC的金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于EBER陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞所占百分比目前尚未統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)腫瘤細(xì)胞EBER陽(yáng)性百分比將EBVaGC劃分為5%5%)腫瘤細(xì)胞顯示EBER陽(yáng)性，也可能有高的PD-L1 CPS評(píng)分和較好的預(yù)后。因此，建議對(duì)EBVaGC行PD-L1檢測(cè)并將檢測(cè)結(jié)果在報(bào)告中注明，為臨床治療提供指導(dǎo)。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表2 EBV相關(guān)性胃癌與非EBV相關(guān)性胃癌性△臨床病理特征比較[n(%)]

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EBVaGC與non-EBVaGC相比，其具有以下臨床病理特點(diǎn)：(1)好發(fā)于近端胃，平均最大徑5.5 cm。(2)Lauren分型以不能確定型最為常見，WHO分型以伴淋巴樣間質(zhì)的癌常見，但其他組織學(xué)亞型腺癌也可以檢出EBV陽(yáng)性[11]。在本組21例EBVaGC中，僅1/3病例為伴淋巴樣間質(zhì)的癌，僅根據(jù)組織學(xué)形態(tài)決定是否行EBER檢測(cè)可能會(huì)導(dǎo)致部分EBVaGC漏診。(3)腫瘤浸潤(rùn)程度淺，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，TNM分期早。(4)與non-EBVaGC相比，EBVaGC中PD-L1 CPS評(píng)分高(85.7%vs28.8%)，尤其在伴淋巴樣間質(zhì)的癌中PD-L1 CPS評(píng)分更高。(5)HER-2狀態(tài)：本組21例EBVaGC免疫組化及FISH檢測(cè)顯示HER-2均無(wú)過(guò)表達(dá)和擴(kuò)增，而對(duì)照組non-EBVaGC(162例，1例未做)中HER-2過(guò)表達(dá)者19例(11.7%)。此外，Bermudez等[15]報(bào)道在non-EBVaGC中16%病例表現(xiàn)出HER-2擴(kuò)增；另有研究顯示胃癌中HER-2過(guò)表達(dá)的發(fā)生率為13.4%[16]。上述研究表明：在EBVaGC中HER-2表達(dá)和HER-2擴(kuò)增均受抑制。(6)Claudin-18.2表達(dá)：本組21例EBVaGC中Claudin-18.2陽(yáng)性率47.6%。目前，我國(guó)關(guān)于Claudin-18.2在胃癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)較少，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2,17-18]發(fā)現(xiàn)，在高加索人中EBVaGC的陽(yáng)性率為77.7%，non-EBVaGC的陽(yáng)性率為32.4%；在日本人群中EBVaGC的陽(yáng)性率為84%，non-EBVaGC的陽(yáng)性率為40%。盡管本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道有差異(推測(cè)可能與不同抗體克隆號(hào)、不同人種及不同陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)有關(guān))，但Claudin-18.2在EBVaGC中的陽(yáng)性率高于non-EBVaGC。此外，有學(xué)者報(bào)道在TCGA 4種分子亞型中，EBV亞型中Claudin-18.2的陽(yáng)性率最高[2]。(7)4種MMR均無(wú)缺失，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[19]。

目前，關(guān)于EBVaGC患者預(yù)后的研究結(jié)果不同。多項(xiàng)研究支持EBV感染是預(yù)后較好的因素，其中TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的一項(xiàng)研究顯示EBVaGC比其他分子亞型預(yù)后好[20]。此外，一項(xiàng)整合了東西方的超大樣本(375/4 244，8.2%)臨床數(shù)據(jù)也顯示EBVaGC患者的生存期更長(zhǎng)[21-22]。然而，少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)EBVaGC與non-EBVaGC患者的預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與以下原因有關(guān)：(1)樣本量小，一些患者尚未出現(xiàn)終點(diǎn)事件，刪失數(shù)據(jù)多，差異不顯著。(2)樣本內(nèi)一些患者具有特殊的分子改變，如TP53[23]、BCOR突變[24]，具有這些分子改變的患者預(yù)后差且免疫治療效果不佳。本組中19例獲得隨訪，5例患者死亡，組織學(xué)類型均為非伴淋巴樣間質(zhì)的癌，且有3例PD-L1 CPS<1，另2例PD-L1 CPS為2，生存時(shí)間1.3～51.67個(gè)月，提示在EBVaGC中組織學(xué)類型為淋巴樣間質(zhì)的癌，PD-L1 CPS評(píng)分高者常伴有良好的預(yù)后[25]。

目前，PD-L1免疫檢查點(diǎn)阻斷劑在治療胃癌方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。在2021年CSCO胃癌診療指南[26]中，對(duì)于HER-2擴(kuò)增陰性的轉(zhuǎn)移性胃癌，PD-L1免疫治療已上升至一線治療(PD-L1 CPS≥1三級(jí)推薦，PD-L1 CPS≥5一級(jí)推薦)。有文獻(xiàn)報(bào)道HER-2陽(yáng)性胃癌和EBVaGC之間無(wú)交叉[27]；本組21例HER-2均無(wú)擴(kuò)增，提示PD-L1阻斷劑如帕博利珠單抗在胃癌(尤其是EBVaGC)治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[28-29]。

Claudin-18.2是Claudin家族的一員，是緊密連接的組成部分，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外屏障功能。Dottermusch等[18]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中Claudin-18.2表達(dá)與EBV感染狀態(tài)有關(guān)，并認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中Claudin-18.2表達(dá)可能與EBV介導(dǎo)的致癌機(jī)制有關(guān)。本組21例EBVaGC中47.6%病例Claudin-18.2陽(yáng)性，提示EBVaGC中Claudin-18.2高表達(dá)有望成為新的潛在治療靶點(diǎn)[30-31]。

綜上所述，EBVaGC是一種具有獨(dú)特臨床病理特征的胃癌，好發(fā)于男性、近端胃、TNM分期早、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低、PD-L1 CPS評(píng)分高，約1/3病例為伴淋巴樣間質(zhì)的癌。此外，與non-EBVaGC相比，EBVaGC中PD-L1 CPS評(píng)分高，Claudin-18.2陽(yáng)性率高，HER-2擴(kuò)增受抑制。盡管EBVaGC預(yù)后有爭(zhēng)議，但絕大多數(shù)文獻(xiàn)均支持該亞型預(yù)后好，生存時(shí)間長(zhǎng)。PD-L1免疫檢查點(diǎn)阻斷劑和Claudin-18.2靶向藥的應(yīng)用，將使更多的EBVaGC患者獲益[32]。