韓如春，常 婧，趙 靜，侯雷平，李梅蘭

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.小店區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局鄉(xiāng)村振興發(fā)展中心，山西 太原 030032）

草莓（Friagaria×ananassaDuch.）為薔薇科草莓屬的多年生草本植物[1]，屬水果性蔬菜，被稱為“水果皇后”，具有較高的栽培價(jià)值[2]。其原產(chǎn)南美，后被世界各地廣泛引種，主要分布于亞洲、南美洲、歐洲等地[3-4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，草莓具有抗衰老作用，對(duì)白血病、腸胃病、障礙性貧血以及動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等疾病具有一定的預(yù)防和治療作用[5-8]，同時(shí)因其管理容易、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)已經(jīng)大面積栽培[9]。依據(jù)區(qū)域位置和自然條件等情況，我國(guó)草莓產(chǎn)地主要可以劃分為三大主產(chǎn)區(qū)，分別是北方產(chǎn)區(qū)、中部產(chǎn)區(qū)和南方產(chǎn)區(qū)[10]。其中，位于北方產(chǎn)區(qū)的山西省草莓種植面積和產(chǎn)量逐年增大，全省各地均建有草莓種植示范基地，在促進(jìn)各地農(nóng)業(yè)高效增收中發(fā)揮著極其重要的作用。

草莓的種苗生產(chǎn)主要采用匍匐莖繁殖，容易導(dǎo)致病毒病的發(fā)生，從而使得種苗不斷退化，出現(xiàn)植株低矮、果畸形、結(jié)果少等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)[11-13]。已有研究表明，通過(guò)莖尖組織培養(yǎng)培育脫毒草莓種苗是防治病毒病的根本對(duì)策[14-15]，該方法繁殖速度越快，脫毒效果越好，能滿足規(guī)模化生產(chǎn)需求[16]，使草莓品種和優(yōu)良特性得以保持，可以有效提高種苗品質(zhì)[17-18]。因此，為獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的草莓，對(duì)建立其組培快繁體系的需求也越來(lái)越大，雖然有關(guān)這方面的研究尚多，但關(guān)于篩選2 個(gè)不同草莓品種的最佳快繁條件的報(bào)道相對(duì)較少，有待于進(jìn)一步完善。

本試驗(yàn)選取紅顏和隋珠2 個(gè)品種的匍匐莖莖尖作為外植體，通過(guò)研究莖尖誘導(dǎo)分化培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和移栽馴化過(guò)程，確定2 個(gè)草莓品種最適宜的激素配比和培養(yǎng)基類型，旨在建立草莓脫毒快繁體系，為今后的生產(chǎn)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

供試材料選用山西省主栽品種紅顏和目前市場(chǎng)上正在興起的新品種隋珠，取樣部位為匍匐莖莖尖。

試劑MS（M519）、Agar（A111）均購(gòu) 自Phyto Technology Laboratories 公司；蔗糖（分析純）購(gòu)自天津凱通化學(xué)試劑有限公司；6-BA 和NAA 均購(gòu)自上海生物工程有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 外植體的獲得和消毒方法篩選 于晴天上午摘取小葉尚未展開的匍匐莖，剪下后迅速插入裝有清水的瓶中；于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，摘掉外部多余的葉片，截取2～3 cm 匍匐莖莖尖，自來(lái)水下流動(dòng)沖洗2 h，用于外植體的消毒。于超凈工作臺(tái)上紫外消毒與通風(fēng)各進(jìn)行20 min后，將處理好的外植體用75%酒精消毒30 s，蒸餾水清洗5次[19]，再用0.1%升汞分別浸泡2、4、6、8、10、12 min，蒸餾水清洗8次。將完成消毒的外植體用已高溫滅菌的小刀、鑷子剝除小葉，切取0.5 mm 左右莖尖[20]，分別接種于初代培養(yǎng)基上。每處理接種3瓶，每瓶5個(gè)外植體，10 d后統(tǒng)計(jì)成活率和污染率，選出最佳的消毒方法。

1.2.2 初代培養(yǎng)基篩選 初代培養(yǎng)基中的6-BA設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度：0、0.1、0.3、0.5、1.0 mg/L；NAA設(shè)置3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度：0、0.1、0.2 mg/L，自由組合后共15個(gè)處理，每個(gè)處理3瓶，每瓶接種5個(gè)莖尖，重復(fù)3 次。初代培養(yǎng)15 d 后統(tǒng)計(jì)成活率，30 d 后統(tǒng)計(jì)誘芽率，以選出最佳的分化培養(yǎng)基。

1.2.3 繼代培養(yǎng)基篩選 篩選到最佳初代培養(yǎng)基后，以2～3苗為一叢，進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶增殖。6-BA設(shè)置2個(gè)濃度梯度：0.3、0.5 mg/L，NAA 設(shè)置3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度：0、0.1、0.2 mg/L，共6 個(gè)組合，每個(gè)組合3 瓶，每瓶接種3個(gè)芽叢，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，以選出最佳的增殖培養(yǎng)基。

增殖系數(shù)＝增殖芽數(shù)量/草莓組培苗不定芽數(shù) （4）

1.2.4 生根培養(yǎng)基篩選 增殖繼代培養(yǎng)30 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)較為健壯并且長(zhǎng)至3～4 cm的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，NAA設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別是0.1、0.3、0.5 mg/L，同時(shí)MS 和1/2 MS單獨(dú)設(shè)置2個(gè)處理，組合后得到5個(gè)處理，每瓶接種2 株草莓小苗，重復(fù)3 次。20 d 后統(tǒng)計(jì)生根率和生根狀況。

生根率＝生根數(shù)/草莓組培苗接種數(shù)×100% （5）

1.2.5 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 MS為誘導(dǎo)和增殖的基本培養(yǎng)基，1/2 MS 為生根時(shí)的基本培養(yǎng)基，各個(gè)培養(yǎng)基均添加30 g/L 蔗糖和7.5 g/L 瓊脂。在添加完MS或1/2 MS和蔗糖之后，先將pH值調(diào)至5.8，再加瓊脂，溶解煮到清透后，分別添加植物激素生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA 和NAA，最后121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌20 min，后冷卻凝固備用。培養(yǎng)溫度24 ℃，光照強(qiáng)度2 600 lx，各培養(yǎng)階段光照時(shí)數(shù)設(shè)定為14 h/d。

1.2.6 移栽馴化 一般通過(guò)繼代增殖后的無(wú)根苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d左右即有10多條根系發(fā)出，此時(shí)即可進(jìn)行馴化移栽。將已達(dá)到馴化移栽條件的組培苗移至溫室，在自然光條件下煉苗7 d 左右，即前2 d先采用閉蓋煉苗方式、中間松蓋煉苗2 d、最后3 d 開蓋煉苗，使組培苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境。煉苗完成后取出組培苗，在水龍頭下流水沖洗掉多余的培養(yǎng)基，再用1 000倍多菌靈浸根消毒后，移栽入已消毒的滅菌基質(zhì)（泥炭∶蛭石∶珍珠巖＝3∶1∶1）中，此時(shí)控制溫室內(nèi)溫度23～27 ℃，空氣相對(duì)濕度40%左右[21]，每天10：00—15：00需進(jìn)行適當(dāng)遮陰，避免日光暴曬，當(dāng)緩苗完成后進(jìn)行成活率統(tǒng)計(jì)調(diào)查。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（α＝0.05）；采用Excel 2003軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)草莓莖尖分化的影響

結(jié)果表明（表1），升汞處理時(shí)間長(zhǎng)短與草莓莖尖的成活率和污染率存在一定關(guān)系。消毒時(shí)間越短，污染率越高，當(dāng)升汞處理時(shí)間為2 min 時(shí)，紅顏和隋珠草莓莖尖污染率最高，分別為33.33%和73.33%；隨著升汞處理時(shí)間的增加，莖尖污染率逐漸呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，成活率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，且均在處理8 min 時(shí)成活率最高，說(shuō)明短時(shí)間處理未能消毒完全，長(zhǎng)時(shí)間處理使莖尖失活。此外，在最優(yōu)消毒處理下，紅顏的成活率（86.70%）高于隋珠（60.00%）。

表1 不同消毒時(shí)間處理對(duì)紅顏和隋珠品種的影響Tab.1 The effect of different disinfect time on Hongyan and Suizhu

2.2 不同激素組合對(duì)草莓莖尖萌發(fā)誘導(dǎo)的影響

從表2 可以看出，2 個(gè)草莓品種的莖尖不添加任何激素也可誘導(dǎo)出芽苗，但成活率和誘芽率偏低；僅添加NAA 時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，誘導(dǎo)出的愈傷組織越來(lái)越多，而且誘芽率也不高；僅添加6-BA 時(shí)，長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于僅添加NAA，誘芽率也較高，但是隨著其質(zhì)量濃度的增加，植株褐化加重，誘芽率也會(huì)降低。

表2 不同激素組合對(duì)紅顏和隋珠莖尖萌發(fā)誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different hormone combinations on shoot tip germination and induction of Hongyan and Suizhu

比較2個(gè)種激素的組合，對(duì)于紅顏品種來(lái)說(shuō)，以處理10即MS＋6-BA 0.3 mg/L＋NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基中成活率最高，誘導(dǎo)出芽苗多，長(zhǎng)勢(shì)也較好；而對(duì)于隋珠品種，誘導(dǎo)成苗效果最好的培養(yǎng)基激素組合是處理12，即MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，成活率達(dá)93.33%，誘芽率達(dá)68.23%，且長(zhǎng)勢(shì)旺盛，葉色翠綠。2個(gè)品種的NAA質(zhì)量濃度均為0.1 mg/L，但是隋珠品種要求的6-BA質(zhì)量濃度略高于紅顏品種?？偠灾?，激素質(zhì)量濃度過(guò)低或過(guò)高都不利于莖尖的萌發(fā)，適宜的激素配比才可促進(jìn)紅顏和隋珠外植體的正常萌發(fā)發(fā)育。

2.3 不同激素組合對(duì)草莓不定芽增殖的影響

經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選到激素質(zhì)量濃度為6-BA 0.3～0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L時(shí)，2個(gè)草莓品種的莖尖成活率較高，所以，繼代培養(yǎng)基以上述激素配比為組合繼續(xù)篩選。由表3可知，紅顏由單獨(dú)苗增殖至芽叢時(shí)間需要20～40 d，而隋珠則需30～50 d。

表3 不同激素組合對(duì)隋珠和紅顏不定芽增殖的影響Tab.3 Effect of different hormone combination on adventitious bud proliferation in Hongyan and Suizhu

比較各個(gè)激素的配方，紅顏草莓最適宜的增殖培養(yǎng)基是5號(hào)培養(yǎng)基，即MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)到5.20；且相同NAA質(zhì)量濃度下，6-BA 0.5 mg/L 處理的增殖系數(shù)高于0.3 mg/L。針對(duì)隋珠品種，其最佳增殖培養(yǎng)基為MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，增殖系數(shù)為4.21；且6-BA 0.5 mg/L 處理的增殖系數(shù)均高于0.3 mg/L 處理，誘導(dǎo)叢芽時(shí)間也縮短，從40～50 d 縮短為30～40 d。綜合來(lái)看，紅顏草莓莖尖分化能力優(yōu)于隋珠，增殖效果良好，誘導(dǎo)出叢芽的時(shí)間也較短，6-BA質(zhì)量濃度一定時(shí)，高質(zhì)量濃度的NAA 更有利于腋芽的增殖，增殖系數(shù)也隨之提高，但6-BA質(zhì)量濃度不宜太高，過(guò)高會(huì)影響草莓腋芽分化增殖。

2.4 不同激素組合對(duì)2種草莓生根培養(yǎng)的影響

將分成單株且長(zhǎng)至3～4 cm的草莓小芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。由表4可知，采用以1/2 MS為基本培養(yǎng)基的2個(gè)草莓品種的生根率顯著高于以MS為基本培養(yǎng)基的處理1，說(shuō)明1/2 MS 比MS 更有利于組培苗生根。對(duì)于紅顏品種，當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2 MS、不添加NAA 時(shí)，生根率高達(dá)100%，平均根數(shù)達(dá)18 條左右，且生根效果最好；隨著NAA 濃度的不斷升高，根基部出現(xiàn)的愈傷組織逐漸增多，生根率有所下降，且影響根系生長(zhǎng)。而對(duì)于隋珠品種，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 時(shí)，生根率最高為100%，生根條數(shù)最多，平均根長(zhǎng)也達(dá)到最長(zhǎng)；當(dāng)NAA質(zhì)量濃度上升為0.3、0.5 mg/L 時(shí)，生根率也達(dá)到100%，但是根長(zhǎng)縮短，愈傷增多，苗黃化，葉卷曲。

表4 不同激素組合對(duì)紅顏和隋珠品種生根的影響Tab.4 The effect of different combinations on rooting of Hongyan and Suizhu

綜合來(lái)看，1/2 MS顯著優(yōu)于MS培養(yǎng)基，1/2 MS和NAA 都能提高生根率和生根數(shù)，其中隋珠品種生根率高，但生根數(shù)少，根條短小，與紅顏品種有所差別。

2.5 移栽馴化

2 個(gè)草莓品種的組培苗生根培養(yǎng)30 d 左右，葉片舒展呈深綠色且出現(xiàn)表皮毛后，即已達(dá)到移栽馴化的條件。自然光照條件下閉蓋、半松蓋、開蓋馴化7 d 后，將其基部培養(yǎng)基洗去，后用1 000 倍多菌靈浸根消毒，然后栽入泥炭∶蛭石∶珍珠巖配比為3∶1∶1的混合基質(zhì)中，使其健康生長(zhǎng)，紅顏和隋珠品種的移栽成活率均高達(dá)100%（圖1）。

3 結(jié)論與討論

在草莓組培快繁試驗(yàn)中，消毒劑所帶來(lái)的消毒效果對(duì)草莓組織培養(yǎng)是否成功有著很大影響。相同濃度的升汞處理時(shí)間不同，對(duì)莖尖的消毒效果也明顯不同，當(dāng)不處理或者處理時(shí)間過(guò)短時(shí)，外植體的污染率最大接近100%；但是當(dāng)升汞處理時(shí)間逐漸增加，其成活率逐漸降低，這可能是由升汞對(duì)外植體本身活力造成了不可逆轉(zhuǎn)的傷害而引起的。由此可見，當(dāng)選用0.1%升汞處理莖尖時(shí)，適宜的處理時(shí)間是關(guān)鍵。本試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇加上0.1%升汞處理8 min 是草莓莖尖消毒的最佳方式，與郭靖[22]的研究結(jié)果一致。

植物激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、含量對(duì)外植體莖尖萌發(fā)影響很大，配比適中可促進(jìn)莖尖細(xì)胞分化能力和細(xì)胞的形態(tài)建成。6-BA屬于細(xì)胞分裂素類，可以很好地促進(jìn)細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)植株形成新芽并誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生；而NAA 能促進(jìn)細(xì)胞的分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根。曹善東[23]經(jīng)研究篩選出2 種組培快繁脫毒草莓苗的培養(yǎng)基配方為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L 和MS＋6-BA 1.0 mg/L＋I(xiàn)AA 1.0 mg/L，發(fā)現(xiàn)6-BA 質(zhì)量濃度大于1.0 mg/L時(shí)，莖尖成活率下降，高質(zhì)量濃度抑制不定芽形成；6-BA質(zhì)量濃度一定時(shí)，高質(zhì)量濃度的NAA更有利于腋芽的增殖，增殖系數(shù)也隨之提高。本研究中，僅添加6-BA 情況下，莖尖也可以萌發(fā)，但誘芽率低，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0.3 mg/L時(shí)，紅顏品種的誘芽率較高，而隋珠品種則是在6-BA 質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時(shí)誘芽率最高；僅添加生長(zhǎng)素時(shí)誘芽率也較低，說(shuō)明在芽的分化過(guò)程中，不單單取決于單一激素的質(zhì)量濃度，而且取決于激素之間的比例，不同品種對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的需求稍有差異。在芽的增殖過(guò)程中，隨著外源激素質(zhì)量濃度的不斷升高，2 個(gè)草莓品種的誘導(dǎo)分化和增殖能力也明顯提高，但是當(dāng)達(dá)到一定的激素配比時(shí)，草莓組培苗發(fā)黃發(fā)褐，長(zhǎng)勢(shì)不好，這與張玲等[24]的研究結(jié)果類似，在他們的試驗(yàn)中，章姬草莓最佳的增殖培養(yǎng)基是MS＋6-BA 0.5 mg/L＋I(xiàn)BA 0.10 mg/L。本研究比較2個(gè)品種，隋珠的增殖效果相比紅顏較差，同時(shí)誘導(dǎo)出叢生芽的時(shí)間也較長(zhǎng)，說(shuō)明基因型會(huì)影響芽體的增殖。顏昌敬[25]研究發(fā)現(xiàn)，草莓試管苗比較容易生根，在無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上就能長(zhǎng)出大量根系，添加NAA 0.1 mg/L后發(fā)根量反而減少。張建盈等[26]研究發(fā)現(xiàn)，不添加IBA 的1/2 MS是白雪公主草莓最適宜的生根培養(yǎng)基，生根率達(dá)100%，平均生根數(shù)為10條，平均根長(zhǎng)為5.00 cm。本研究中，隋珠品種的生根率在有激素時(shí)較高，而紅顏品種沒有激素時(shí)生根率就可以達(dá)到100%，而且平均生根數(shù)是隋珠的3倍左右，表明不同草莓品種生根所需要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類型有所不同，同時(shí)適宜的激素配比有利于組培苗的生根。

2 個(gè)草莓品種的莖尖誘導(dǎo)成活率、腋芽增殖分化能力和生根能力都有所區(qū)別，這可能是由于不同的品種會(huì)對(duì)不同培養(yǎng)基的激素配比存在不同的敏感程度，外部條件如生長(zhǎng)環(huán)境和植株本身種性等原因都會(huì)造成它們的莖尖萌發(fā)能力、腋芽增殖能力及生根率等都有所不同。在本試驗(yàn)草莓組培的過(guò)程中，出現(xiàn)了褐化和玻璃化等問(wèn)題，仍需要進(jìn)行更深一步的相關(guān)研究。

本研究結(jié)果表明，草莓紅顏和隋珠品種0.1%HgCI2滅菌的最佳時(shí)間均為8 min，成活率分別達(dá)86.70%和60.00%。最適宜的莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基紅顏品種是MS＋6-BA 0.3 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，而隋珠品種為MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，誘芽率分別為68.00%和68.23%。最適宜的繼代增殖培養(yǎng)基紅顏品種是MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，隋珠品種為MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，增殖系數(shù)分別達(dá)5.20 和4.21。紅顏品種最適宜的生根培養(yǎng)基是1/2 MS，而隋珠品種需在1/2 MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入NAA 0.1 mg/L，生根率均達(dá)到100%。無(wú)菌苗移栽于泥炭∶蛭石∶珍珠巖為3∶1∶1的混合基質(zhì)中，均可成活，且長(zhǎng)勢(shì)良好。