梁澤華， 潘穎潔， 邱麗媛， 袁 強(qiáng)， 徐曉強(qiáng)， 舒月文

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311400;2.浙江棗椿堂農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 龍游 324402)

黃精為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl. et Hemsl.、黃精PolygonatumsibiricumRed. 或多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua 的干燥根莖，味甘、性平，入脾、腎、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效[1]，常用于治療肺虛燥咳、腎精虧虛、腰膝酸軟[2]以及脾胃虛弱之癥，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身之功效?，F(xiàn)代藥理研究證明，黃精具有增強(qiáng)免疫、降血糖、降血脂、抗高血壓、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[3-8]。

黃精用藥歷史悠久，常以口服單用作用滋補(bǔ)，但生品具有咽喉刺激性及麻舌感，因此常以炮制品入藥，其中蒸九曬品作為“四大蒸貨”之一，其刺激性成分黃精黏液質(zhì)含量明顯降低[9]，補(bǔ)益功效增強(qiáng)，有利于患者的服用。但九蒸九曬品的功效目前主要依據(jù)傳統(tǒng)的臨床經(jīng)驗(yàn)，缺乏科學(xué)全面的理論依據(jù)，而且工藝復(fù)雜，耗時長，對于其蒸曬次數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)尚存在爭議。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選并識別黃精九蒸九曬過程中的差異性成分[10-17]，為相關(guān)炮制機(jī)制的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材 黃精(產(chǎn)地浙江龍游)由浙江棗椿堂農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)黃真教授鑒定為百合科植物多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根莖。

1.2 試劑 甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(德國默克公司)；甲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.3 儀器 SYNAPT G2-Si高分辨四級飛行時間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀(美國沃特世公司)；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；150T多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)；KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 藥材炮制 取生品適量，除去雜質(zhì)，洗凈，將黃酒與其攪拌均勻，并悶潤至吸盡(每100 kg水平用黃酒20 kg)，要求第1次蒸制至黃精中央發(fā)虛，放在太陽下曬至藥材外皮微干，之后將上一步生品拌入收集的汁液和一定量黃酒，并“悶潤至輔料被藥材吸盡”，按第1回蒸制、干燥方法處理，放到太陽底下曬至藥材表面微干，再拌入上一步收集的汁液和一定量黃酒，同法連續(xù)操作，得到一蒸一曬品、三蒸三曬品、五蒸五曬品、七蒸七曬品、九蒸九曬品，置于60 ℃烘箱中烘干。

2.2 預(yù)處理 取“2.1”項(xiàng)下生品和炮制品，分別精密稱取(過四號篩)4 g，加入70%乙醇100 mL，超聲提取30 min，共2次，合并濾液，減壓濃縮，70%甲醇復(fù)溶，PSL固相萃取小柱，20 mL甲醇活化，20 mL超純水洗滌，取5 mL倒入固相萃取小柱中，20 mL超純水淋洗，40 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，70%甲醇復(fù)溶并定容至25 mL，12 000 r/min離心取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3 LC-MS分析條件

2.3.1 色譜 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～8 min，5%～21%A；8～17 min，21%～22%A；17～20 min，22%～40%A；20～30 min，40%～45%A；30～40 min，45%～73%A；40～45 min，73%～100%A；45～47 min，100%A；47～47.1 min，100%～5%A；47.1～50 min，5%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜 SYNAPT G2-Si Q-TOF質(zhì)譜儀；MSEcontinuum模式；掃描范圍m/z50～1 500。在ESI-模式下；毛細(xì)管電壓3.00 kV；錐孔電壓40 V；溫度120 ℃時錐氣孔體積流量50 L/h；溫度400 ℃時脫溶劑氣體積流量800 L/h。以1 ng/μL亮氨酸-腦啡肽(ESI-,m/z555.261 5)為校正標(biāo)準(zhǔn)液。

2.3.3 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫建立 從Sciencedirect、Web of Science、CNKI、TCMSP等數(shù)據(jù)庫收集黃精屬植物化學(xué)成分及期名稱，采用Masslynx V4.1軟件中的Molecular Weight Calculator工具計(jì)算相對分子質(zhì)量，建立包括名稱、分子式、相對分子質(zhì)量、[M-H]-、[2 M-H]-、[M-H+HCOOH]-等信息的數(shù)據(jù)庫。

2.4 數(shù)據(jù)處理 取生品、炮制品溶液各200 μL，制成質(zhì)控(QC)樣品。進(jìn)樣前先運(yùn)行5個QC樣品以使儀器穩(wěn)定，然后每進(jìn)9個樣品運(yùn)行1次，監(jiān)測儀器穩(wěn)定性和重復(fù)性。所采集的原始數(shù)據(jù)先通過Progenesis QI軟件進(jìn)行峰對齊、峰提取、峰鑒別、歸一化等預(yù)處理，再將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件，進(jìn)行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)。

3 結(jié)果

3.1 多元統(tǒng)計(jì)分析 “2.1”項(xiàng)下生品和炮制品中共得到7個主成分，累積R2X=0.892，Q2=0.815，表明模型具有良好的預(yù)測能力。圖1顯示，QC樣品高度集中，表明該方法穩(wěn)定可靠；七蒸七曬品與九蒸九曬品重疊，未達(dá)到明顯分離，而其余樣品分布在不同區(qū)域，表明兩者代謝產(chǎn)物相似，與其余樣品之間存在差異。圖2顯示，除了七蒸七曬品與九蒸九曬品之間存在交叉，其余樣品區(qū)分明顯，組內(nèi)平行樣品成分接近。

注：1為生黃精，2為一蒸一曬品，3為三蒸三曬品，4為五蒸五曬品，5為七蒸七曬品，6為九蒸九曬品。圖1 生品和炮制品PCA得分圖

圖2 生品和炮制品聚類熱圖

為了鑒別造成生品和炮制品之間分離的主要差異代謝成分，又建立了OPLC-DA模型，見圖3，可知R2Y、Q2均大于0.9，表明模型構(gòu)建良好，預(yù)測性可靠。

3.2 差異代謝成分篩選和鑒別 通過OPLS-DA分析得到S型圖(S-plot，圖4)和變量重要性投影(VIP)值，以VIP值>1、P<0.05為條件篩選尋找差異代謝物，對比自建黃精化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫和ChemSpider數(shù)據(jù)庫，同時根據(jù)所獲得的精確相對分子質(zhì)量結(jié)合色譜保留行為、質(zhì)譜裂解規(guī)律、特征碎片離子以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，最終鑒別出37種差異代謝物，包含19種甾體皂苷、5種脂肪酸、3種黃酮、2種糖類、2種木脂素、2種有機(jī)酸、1種氨基酸、1種生物堿、2種未知成分，見表1。

倍數(shù)變化(FC)代表炮制品、生品中代謝物含量的比值，F(xiàn)C>1代表前者含量高于后者，F(xiàn)C<1代表后者含量低于前者。表2、圖5顯示，以pratioside H、sibiricoside A 為代表的大分子原生苷含量隨著炮制時間延長不斷降低，tianshic acid、palmitic acid等小分子化合物含量升高，鵝掌楸苷、橙皮苷等成分含量先升后降。

5 討論與結(jié)論

注：A為生品與一蒸一曬品，B為生品與三蒸三曬品，C為生品與五蒸五曬品，D為生品與七蒸七曬品，E為生品與九蒸九曬品。圖3 生品和炮制品OPLS-DA得分圖

九蒸九曬品作為藥食同源之品具有很高的養(yǎng)生價值，但生品具有咽喉刺激的副作用，九蒸九曬后可降低咽喉刺激性，增強(qiáng)補(bǔ)益功效，然而對其炮制機(jī)制的探索尚不明確，本實(shí)驗(yàn)對黃精生品、一蒸一曬品、三蒸三曬品、五蒸五曬品、七蒸七曬品、九蒸九曬品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，對黃精九蒸九曬過程中的化學(xué)成分進(jìn)行識別分析，最終鑒定了37個差異代謝產(chǎn)物，其中甾體皂苷類成分占差異代謝產(chǎn)物的51.4%，為主要差異成分，而19個甾體皂苷類成分中，26-三醇-3-O-β-石蒜四糖苷及其異構(gòu)體、甲基薯蕷皂苷及其異構(gòu)體等10個成分在黃精九蒸九曬過程中呈現(xiàn)下降趨勢，推測甾體皂苷在九蒸九曬過程中遇熱水解，脫去糖基形成了次級苷或苷元；polygonatumoside F及其異構(gòu)體等8個成分在黃精九蒸九曬過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而kingianoside A及其異構(gòu)體是黃精九蒸九曬過程中呈上升趨勢的甾體皂苷、推測與大分子原生苷脫去糖基后的次級苷及其異構(gòu)體的產(chǎn)生，以及進(jìn)一步脫去糖基有關(guān)。同時，篩選所得的黃精黃酮類成分在九蒸九曬過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，異甘草素及其異構(gòu)體與2′,7-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷及其異構(gòu)體在一蒸一曬品中的含量最高，而橙皮苷及其異構(gòu)體三蒸三曬品中的含量最高，甾體皂苷類成分和黃酮類成分作為黃精主要藥效成分，具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等功效，但是對其單一成分的藥效研究并不多見，本研究表明黃精九蒸九曬主要差異成分多為甾體皂苷、但與黃精九蒸九曬過程中的藥效變化規(guī)律之間的關(guān)系尚且需要進(jìn)一步探索。

注：A為生品與一蒸一曬品，B為生品與三蒸三曬品，C為生品與五蒸五曬品，D為生品與七蒸七曬品，E為生品與九蒸九曬品。圖4 生品和炮制品S-plot圖

表1 炮制品中差異代謝物

續(xù)表1

表2 生品和炮制品中差異代謝物變化

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

注：A為生品與一蒸一曬品，B為生品與三蒸三曬品，C為生品與五蒸五曬品，D為生品與七蒸七曬品，E為生品與九蒸九曬品。圖5 生品與炮制品差異代謝成分熱圖