萬恒東 岳文濤 趙 鋒 商憲富 陳道文 王思文 孫明超劉 權(quán)*

（1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319；2北大荒集團(tuán)九三分公司紅五月農(nóng)場，黑龍江嫩江 161400）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種分布廣泛的生防菌，能夠分泌多種蛋白類和激素類活性物質(zhì)，天然無毒害，是一種高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的微生物菌株，具有生長繁殖速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、利于大量培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)[1]。隨著綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，生物農(nóng)藥及肥料市場對枯草芽孢桿菌及其衍生產(chǎn)品的需求與日俱增[2]。

AMEP蛋白是從枯草芽孢桿菌BU412中鑒定的一種新型蛋白激發(fā)子，能夠激發(fā)植物免疫系統(tǒng)，提高植物對病害的抗性[3]。高濃度的AMEP蛋白接種植物葉片會(huì)觸發(fā)植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)。過敏反應(yīng)是細(xì)胞死亡的一種形式，屬于植物早期的防衛(wèi)反應(yīng)，是用來檢驗(yàn)蛋白激發(fā)子功能活性的常用方法。

為了節(jié)省施用環(huán)節(jié)的成本，AMEP蛋白制劑在應(yīng)用時(shí)應(yīng)考慮與葉面肥混用，也是現(xiàn)階段藥肥一體化的趨勢[4]。葉面肥是指向除作物根系以外的營養(yǎng)體表面施用的肥料，具有肥料利用效率高、用量少、養(yǎng)分吸收快、肥效好、針對性強(qiáng)、便于噴施等特點(diǎn)[5-6]。尿素不僅能夠快速為植物提供氮源，而且對表皮細(xì)胞的角質(zhì)層有軟化作用，是葉面肥的主要成分之一[7-10]。但需要注意，尿素也是一種強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，能改變蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性[11]。尿素分子可與蛋白質(zhì)分子上的羥基作用，打斷蛋白質(zhì)體系中的氫鍵，改變分子構(gòu)象，暴露出非極性基團(tuán)，β-折疊含量減少，無規(guī)則卷曲含量增加；肽鏈的某些片段會(huì)呈一定程度的伸展?fàn)顟B(tài)，使蛋白質(zhì)分子的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)改變，即蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性[12-14]。由此可見，在AMEP蛋白制劑與葉面肥混用過程中，尿素對蛋白質(zhì)變性的影響必須要重點(diǎn)考慮，以確保AMEP蛋白的功能活性不受影響。

本文從枯草芽孢桿菌中提取AMEP蛋白，經(jīng)過一系列純化后，設(shè)置了3個(gè)不同濃度的尿素對AMEP蛋白進(jìn)行混合處理，通過過敏反應(yīng)活性測試的方法探究了尿素濃度對AMEP功能活性的影響。本試驗(yàn)在確定最適尿素濃度后，通過灰霉菌接種試驗(yàn)檢驗(yàn)了尿素與AMEP混用后對植物抗病性的影響，旨在為提高葉面肥利用率提供理論基礎(chǔ)，也為今后AMEP蛋白制劑的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試煙草植株及菌株。供試煙草植株生長于24～26℃人工氣候室，每天光照培養(yǎng)12 h，生長6周后的葉片用于過敏反應(yīng)試驗(yàn)。

供試菌株為枯草芽孢桿菌BU412，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物與微生物互作實(shí)驗(yàn)室分離并保存于中國模式菌種收集中心，用于AMEP的表達(dá)?；颐咕暧珊邶埥艘晦r(nóng)墾大學(xué)植物與微生物互作實(shí)驗(yàn)室保藏，用于灰霉菌發(fā)病試驗(yàn)。

1.1.2 供試試劑。①酵母麥芽提取物液體培養(yǎng)基（YME）：麥芽糖 10 g/L、酵母提取物 4 g/L、葡萄糖4 g/L、pH值7.2，用于枯草芽孢桿菌BU412菌株的培養(yǎng)。②PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，用于灰霉菌的培養(yǎng)。③緩沖液：低鹽緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl，高鹽緩沖液為 20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L NaCl。 ④尿素：國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 AMEP蛋白制備。①菌株培養(yǎng)。在超凈環(huán)境中，挑取固體培養(yǎng)基上枯草芽孢桿菌BU412的單菌落，接種至5 mL YME液體培養(yǎng)基的試管中，在32℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)液按1∶100的比例接種至300 mL的YME液體培養(yǎng)基中，在32℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)22 h。②蛋白純化。菌液經(jīng)11 000×g低溫離心，時(shí)間為15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾除雜，通過AKTA蛋白純化儀進(jìn)行蛋白純化。先用HiTrap Q HP column（5 mL）進(jìn)行第一步純化，使用低鹽緩沖液進(jìn)行預(yù)平衡，將上清液上樣至離子交換柱，上樣完畢后使用低鹽緩沖液平衡柱子，隨后使用40%高鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集蛋白樣品。第二步使用截留體積為30 kDa的Amicon超濾管對蛋白樣品進(jìn)行超濾，用低鹽緩沖液反復(fù)超濾，舍去濾掉的樣品，收集截留部分樣品，即為AMEP蛋白樣品。使用Nanodrop進(jìn)行蛋白濃度測定，并調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至0.5 mg/mL。

1.2.2 過敏反應(yīng)。本次試驗(yàn)以過敏反應(yīng)程度作為檢測指標(biāo)，將AMEP中加入不同濃度的尿素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在固定AMEP濃度和用量不變的條件下，采用單因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，預(yù)先配制5 mg/mL尿素溶液（高濃度溶液），并對其稀釋10倍（中濃度溶液）和100倍（低濃度溶液）。取1 mg/mL蛋白溶液100 μL分別與400 μL高、中、低濃度的尿素溶液混合，分別得到0.5 mL含高、中、低濃度尿素的蛋白溶液。隨后通過無針注射器注射到煙草葉片背面，以同等濃度尿素溶液作為對照，24 h后檢查注射部位的壞死斑現(xiàn)象，從而確定尿素對AMEP功能活性的影響。

1.2.3 灰霉菌發(fā)病試驗(yàn)。取培養(yǎng)6周的煙草葉片，噴施50 μg/mL AMEP蛋白與0.05 mg/mL尿素混合溶液進(jìn)行免疫激活處理，以相同濃度尿素溶液作為對照。保濕2 d后，取灰霉菌塊接種至煙草葉片背面，于28℃條件下保濕培養(yǎng)進(jìn)行發(fā)病處理，3 d后觀察灰霉病斑并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿素對AMEP功能活性的影響

從圖1可以看出，加入0.05、0.50、5.00 mg/mL等3個(gè)濃度尿素的AMEP均可使煙草葉片產(chǎn)生過敏反應(yīng)，同等濃度尿素溶液的處理沒有產(chǎn)生過敏反應(yīng)。其中，0.05 mg/mL尿素使煙草葉片發(fā)生過敏反應(yīng)的效果最好，隨著尿素濃度的增加，過敏反應(yīng)程度逐漸減弱。

2.2 尿素與AMEP混合液對灰霉病的影響

以灰霉菌感染煙草葉片，使煙草葉片發(fā)病，再噴灑50 μg/mL AMEP蛋白與0.05 mg/mL尿素混合溶液對煙草葉片進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，以相同濃度尿素為對照。由圖2可知，噴灑0.05 mg/mL尿素與50 μg/mL AMEP蛋白混合液的煙草葉片能有效減輕煙草灰霉病的發(fā)病程度，而噴灑同濃度尿素溶液的葉片被灰霉菌感染，說明AMEP蛋白對灰霉菌有抑制作用。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過過敏反應(yīng)測試了不同濃度尿素對AMEP蛋白功能活性的影響，結(jié)果表明，0.05 mg/mL尿素使煙草葉片發(fā)生過敏反應(yīng)效果最好，隨著尿素濃度的增加，AMEP蛋白使煙草葉片發(fā)生過敏反應(yīng)的程度減弱。由此判斷，尿素濃度增加后，AMEP蛋白可能發(fā)生了變性，導(dǎo)致AMEP蛋白功能活性降低，從而減弱了過敏反應(yīng)的程度。尹翠玉等[10]對大豆蛋白的脲變性及結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不同濃度尿素使大豆蛋白變性的程度不同。本次試驗(yàn)結(jié)果與其研究結(jié)果相符，說明AMEP蛋白具備蛋白質(zhì)的共同性質(zhì)。張忠慧等[15]進(jìn)行了大豆分離蛋白與低濃度尿素相互作用的紅外光譜分析，結(jié)果表明：溶解在不同濃度尿素溶液中的大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)與大豆分離蛋白的水溶液相比發(fā)生了很大的變化，在0.05 mg/mL尿素溶液中，大豆分離蛋白中的β-折疊含量最小，隨著尿素濃度的增加，β-折疊的含量增加；無規(guī)則卷曲的含量在0.05 mg/mL尿素溶液中達(dá)到最大，之后隨尿素濃度增加而降低；α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量隨著尿素濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。以上研究均表明，高濃度尿素會(huì)對蛋白產(chǎn)生變性作用，對其功能活性產(chǎn)生極大的影響。

經(jīng)過單因素試驗(yàn)篩選，確認(rèn)AMEP蛋白能夠與0.05 mg/mL尿素配伍使用，其活性不受影響。在過敏反應(yīng)測試中，0.5 mg/mL AMEP蛋白與0.05 mg/mL尿素混合使用，能夠有效誘導(dǎo)過敏反應(yīng)出現(xiàn)。在灰霉菌發(fā)病試驗(yàn)中，50 μg/mL AMEP蛋白與0.05 mg/mL尿素混合處理煙草后，能有效降低灰霉病發(fā)病率。以上結(jié)果說明，0.05 mg/mL尿素與AMEP蛋白可共用，能順利觸發(fā)煙草防御反應(yīng)誘導(dǎo)系統(tǒng)，增強(qiáng)煙草葉片對灰霉病的抗性，不會(huì)對其功能活性產(chǎn)生負(fù)面作用。

綜上所述，尿素溶液在低濃度時(shí)，對AMEP蛋白的功能活性無負(fù)面作用；但當(dāng)尿素濃度過高，AMEP蛋白的功能活性隨著尿素濃度的增加而減弱。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，葉菜類植物在苗期、中后期可噴施1%～2%尿素溶液，為植物提供充足的氮肥，防止葉片泛黃，加速植物生長。經(jīng)換算，本試驗(yàn)確定的尿素使用濃度為0.05%，遠(yuǎn)低于葉面肥中尿素的常規(guī)用量。由此表明，蛋白類生物制劑在與葉面肥搭配使用時(shí)，應(yīng)格外注意高濃度尿素對蛋白活性的影響。