樊懿萱，王心意，鞠建慶，陳 卓，張 艷，徐 浩

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多種心臟疾病的終末期階段。由于各種原因造成心臟結(jié)構(gòu)和/或功能變化，心室的收縮和/或舒張功能障礙，從而引起以呼吸困難、勞累疲乏、液體潴留等為主要表現(xiàn)的一組復(fù)雜綜合征[1]。至2019年，我國(guó)心血管病病人約3.30億人，其中心力衰竭病人約890萬(wàn)人[2]。目前CHF的藥物治療以利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑為主。但是CHF病程較長(zhǎng)，后期發(fā)展為多器官、多系統(tǒng)的損害，西藥治療受到一定限制，且長(zhǎng)期應(yīng)用西藥副作用較多[3]，治療效果不佳。CHF屬于中醫(yī)學(xué)“心衰病”的范疇，根據(jù)主要癥狀不同，分屬中醫(yī)學(xué)“水腫”“痰飲”“虛勞”等范疇。五苓散出自“醫(yī)圣”張仲景所著《傷寒論》，原文中8處提及五苓散，以溫陽(yáng)化氣利水為主。現(xiàn)代研究證實(shí)，在CHF基礎(chǔ)用藥上加用五苓散，心力衰竭癥狀明顯緩解，同時(shí)降低腦鈉肽(BNP)等心力衰竭實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)水平，提高心臟收縮能力，具有降脂、降壓、利尿等功效，可有效改善心臟功能[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)及藥理學(xué)相關(guān)知識(shí)，而研究中藥時(shí)又結(jié)合了中醫(yī)哲學(xué)，包括中藥與方劑學(xué)的相關(guān)知識(shí)。中藥復(fù)方的研究在網(wǎng)絡(luò)信息中量化，通過尋找藥物中多種化合物成分，建立藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)[5]。分子對(duì)接主要運(yùn)用計(jì)算機(jī)技術(shù)，立足于現(xiàn)代藥理學(xué)基礎(chǔ)，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)結(jié)果[6]，同時(shí)從分子機(jī)制分析中藥復(fù)方，為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供參考。本研究借鑒網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討五苓散對(duì)CHF作用的相關(guān)分子機(jī)制，同時(shí)運(yùn)用分子對(duì)接方法進(jìn)行驗(yàn)證，為五苓散治療CHF提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物與疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立

1.1.1 五苓散藥物靶點(diǎn)篩選 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)，分別以“白術(shù)”“澤瀉”“豬苓”“茯苓”“桂枝”為關(guān)鍵詞檢索五苓散組成藥物的主要成分，根據(jù)TCMSP中的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及生物活性分子類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選五苓散組方藥物中符合條件的化合物作為活性成分，同時(shí)在TCMSP平臺(tái)中篩選出活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，將相應(yīng)靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)及DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)。STRING及DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)作為補(bǔ)充，挖掘相應(yīng)靶點(diǎn)信息。3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均選擇物種為“人”(Homo sapiens)，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的靶基因。

1.1.2 疾病靶點(diǎn)篩選 以“chronic heart failure”為關(guān)鍵詞，分別檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/drugs)，DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)?？偨Y(jié)已有報(bào)道的CHF相關(guān)靶點(diǎn)基因，GeneCards與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)由于提取基因較多，通過Relevance score取二倍中位數(shù)篩選與疾病相關(guān)度較高的基因靶點(diǎn)，合并所有數(shù)據(jù)庫(kù)，去除重復(fù)基因，得到疾病基因庫(kù)，作為交集網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的基礎(chǔ)。

1.1.3 五苓散藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 建立五苓散藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)文件，將五苓散藥物中的活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，進(jìn)行可視化處理，通過軟件自帶Analyze Network功能分析網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)自由度(Degree)值篩選出關(guān)鍵藥物成分。

1.1.4 尋找藥物與疾病交集靶點(diǎn)并構(gòu)建韋恩圖 將藥物與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)分析與可視化網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn)，構(gòu)建交集韋恩圖，得到五苓散與CHF的交集基因。

1.1.5 五苓散藥物成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)建立與關(guān)鍵化合物選取 將藥物有效成分及交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中，構(gòu)建成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)，通過Degree值與中位數(shù)篩選五苓散關(guān)鍵化合物。

1.1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將交集基因?qū)隨TRING平臺(tái)，選擇物種為Homo sapiens，自動(dòng)生成蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)將生成的蛋白節(jié)點(diǎn)信息以tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，通過Analyze Network及CytoNCA插件分析PPI，利用Degree、中心性(closeness)及介數(shù)(betweenness)與中位數(shù)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2 基因本體(GO)分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 利用Metascape平臺(tái)(http://www.metascape.org/)分析交集基因，導(dǎo)入基因后選擇物種為H.sapiens，通過平臺(tái)進(jìn)行GO及KEGG分析，得到關(guān)鍵生物過程(biological processes，BP)、細(xì)胞組成(cellular components，CC)、分子功能(molecular functions，MF)及KEGG通路(KEGG pathway)，結(jié)果篩選后導(dǎo)入可視化平臺(tái)得到GO及KEGG直方圖。

1.3 分子對(duì)接 在TCMSP平臺(tái)中搜索關(guān)鍵化合物結(jié)構(gòu)，保存為mol2文件。陽(yáng)性對(duì)照藥物選擇利尿劑托伐普坦。該藥物通常在CHF病人使用呋塞米等常規(guī)利尿劑發(fā)生抵抗或者出現(xiàn)腎臟損害時(shí)應(yīng)用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)藥物和呋塞米基礎(chǔ)上加用五苓散，治療后病人呋塞米用量減少，且利尿劑抵抗發(fā)生率明顯降低[8]，故將五苓散與托伐普坦對(duì)比。在DrugBank平臺(tái)中得到托伐普坦化學(xué)結(jié)構(gòu)式，保存為mol2文件，為分子對(duì)接做準(zhǔn)備。將篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)與KEGG通路富集的基因進(jìn)行比較，選擇主要靶點(diǎn)；將靶點(diǎn)導(dǎo)入PDB網(wǎng)站(http://www.rcsb.org/)，得到對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白及PDB編碼(PDB ID)，保存蛋白結(jié)構(gòu)為pdb文件。將mol2及pdb文件導(dǎo)入CB-Dock在線對(duì)接平臺(tái)(http://cao.labshare.cn/cb-dock/)，平臺(tái)基于Autodock vina 1.1.2版本進(jìn)行在線對(duì)接，對(duì)接過程相對(duì)快速，且成功概率較大。對(duì)接結(jié)果中得到Vina分?jǐn)?shù)(Vina score)與腔體大小。Vina分?jǐn)?shù)的數(shù)值越低，結(jié)合能力越強(qiáng)，受體和配體的親和力越好，并且腔體的大小接近或大于配體，對(duì)接的準(zhǔn)確性就會(huì)提高。

2 結(jié) 果

2.1 五苓散藥物成分的篩選結(jié)果 得到五苓散藥物成分共49個(gè)，分別為白術(shù)7個(gè)、澤瀉9個(gè)、豬苓11個(gè)、茯苓15個(gè)、桂枝7個(gè)，去重后共有46個(gè)。詳見表1。

表1 五苓散中化合物基本信息

(續(xù)表)

2.2 五苓散藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 篩選出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的五苓散活性成分共30個(gè)，對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)去重后共計(jì)67個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)化后得到靶基因共63個(gè)。構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共包含95個(gè)節(jié)點(diǎn)、165條邊，體現(xiàn)了五苓散多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。詳見圖1。

圖1 五苓散藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(綠色圓形代表藥物名稱；六邊形及菱形代表藥物活性成分；藍(lán)色圓形代表藥物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn))

2.3 CHF靶點(diǎn)篩選及交集基因 合并數(shù)據(jù)庫(kù)并去重后得到CHF相關(guān)基因共1 529個(gè)，將藥物和疾病基因?qū)朐诰€可視化平臺(tái)，得到五苓散與CHF交集靶點(diǎn)共36個(gè)。詳見圖2。

圖2 五苓散與疾病交集韋恩圖

2.4 藥物成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵藥物成分篩選 構(gòu)建藥物成分-交集靶點(diǎn)圖，網(wǎng)絡(luò)圖共有63個(gè)節(jié)點(diǎn)、85條邊，詳見圖3。共計(jì)有10個(gè)關(guān)鍵成分。五苓散5種藥物囊括關(guān)鍵活性成分，且桂枝所占比例最多，可見在五苓散治療CHF的過程中，桂枝發(fā)揮的治療作用尤為突出。詳見表2。

圖3 藥物成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圓形代表藥物活性成分；菱形代表藥物與疾病交集靶點(diǎn))

表2 五苓散關(guān)鍵藥物成分

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)建立及關(guān)鍵靶點(diǎn)選取 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖4)。分析PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出排名前10位的關(guān)鍵靶點(diǎn)，靶點(diǎn)以NOS3、CASP3、PTGS2、HSP90AA1、CAT等為主，具體靶點(diǎn)詳見表3。

表3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(前10位基因)

圖4 交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO分析 GO分析結(jié)果富集在BP、CC、MF的分別有576個(gè)、32個(gè)、54個(gè)，分別選取前10位形成直方圖。BP主要集中在血液循環(huán)(blood circulation)、循環(huán)系統(tǒng)流程(circulatory system process)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)(cellular response to organic cyclic compound)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程(vascular process in circulatory system)等，以循環(huán)系統(tǒng)作用為主，和CHF密切相關(guān)；CC富集結(jié)果主要與細(xì)胞膜相關(guān)；MF主要富集于蛋白質(zhì)均二聚活性(protein homodimerization activity)、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(protein domain specific binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、支架蛋白結(jié)合(scaffold protein binding)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)等多種功能。詳見圖5。

圖5 GO生物過程、細(xì)胞組成、分子功能分析直方圖(前10位)

2.7 KEGG富集分析及通路-靶點(diǎn)-藥物成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 KEGG信號(hào)通路富集中靶點(diǎn)數(shù)居前20位的信號(hào)通路主要包括：AGE-RAGE信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號(hào)通路、刺激神經(jīng)組織的中的交互、鈣信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、點(diǎn)樣受體信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路，詳見圖6。每條通路富集多個(gè)基因，體現(xiàn)了五苓散多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

圖6 KEGG通路富集分析(前20位)

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證 最終篩選出NOS3、CASP3、PTGS2、HSP90AA1、CAT、JUN、ESR1、RELA、NR3C1、CASP8共10個(gè)靶點(diǎn)。除CASP3沒有對(duì)應(yīng)的表達(dá)合適的PDB ID外，其余均有一定對(duì)接能力。并且Vina分?jǐn)?shù)與腔體大小基本接近于托伐普坦，化合物與NOS3和PTGS2的結(jié)合力較好，詳見表4、表5?？梢暬治鰧?duì)接結(jié)果，可見靶點(diǎn)蛋白與活性成分對(duì)接結(jié)構(gòu)，選擇Vina分?jǐn)?shù)后4位作圖，共有5組對(duì)接，同時(shí)與托伐普坦比較，詳見圖7。

表4 化合物及托伐普坦與靶點(diǎn)對(duì)接的Vina 分?jǐn)?shù)

表5 化合物及托伐普坦與靶點(diǎn)對(duì)接的腔體大小

圖7 配體與大分子對(duì)接結(jié)果可視化分析

3 討 論

CHF的中醫(yī)病機(jī)以“虛、瘀、水”為基礎(chǔ)，以益氣、養(yǎng)陰、溫陽(yáng)、活血、利水為主要治則，其中水飲內(nèi)停的主要選方為五苓散[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為心肌重構(gòu)是CHF發(fā)生發(fā)展的重要病理生理學(xué)過程[1]，心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激是促進(jìn)心肌重構(gòu)的主要病理機(jī)制[10]。針對(duì)五苓散君藥澤瀉的藥理研究，已明確其具有利尿、降低血脂作用，并且可以減少氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的活性氧(ROS)，抵抗氧化損傷，還能通過抑制NF-κB通路起到抗炎作用[11]。含有關(guān)鍵化合物最多的桂枝，治療心血管疾病的作用顯著，具有良好的降血壓、擴(kuò)血管作用，同時(shí)也發(fā)揮抗炎作用[12]。本研究挖掘獲得五苓散多個(gè)活性成分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，β-谷甾醇可以調(diào)節(jié)凋亡基因從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，而二氫槲皮素具有抗氧化作用，通過調(diào)節(jié)心肌組織中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性，抑制氧化應(yīng)激，防止心肌缺血損傷[13]。常春藤皂甙元可以降低高脂血癥大鼠的血液黏度[14]，改善血流動(dòng)力學(xué)，降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。兒茶素具有抗氧化、抗炎及改善血管內(nèi)皮障礙的作用[15]，并且兒茶素競(jìng)爭(zhēng)性抑制磷酸二酯酶，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，具有擴(kuò)張血管、產(chǎn)生正性肌力的作用，改善血流動(dòng)力學(xué)，同時(shí)抑制心肌細(xì)胞凋亡。與米力農(nóng)等磷酸二酯酶抑制劑相比，兒茶素屬于天然藥物，對(duì)心臟的副作用較小，應(yīng)用于CHF更加安全[16]。

本研究篩選出NOS3、CASP3、PTGS2、HSP90AA1、CAT、JUN、ESR1、RELA、NR3C1、ICAM1等關(guān)鍵靶標(biāo)，靶標(biāo)通過相關(guān)通路發(fā)揮作用。血管中一氧化氮(NO)的釋放，有賴于NOS3的誘導(dǎo)。NO可以幫助血管舒張，防止血小板聚集，阻止血栓的產(chǎn)生，起到了保護(hù)血管、防止動(dòng)脈粥樣硬化的作用[17-18]。通過實(shí)驗(yàn)基本確定調(diào)節(jié)NOS3可以改善左心室再灌注心肌損傷，有望減輕左心室不良重構(gòu)[19]。CASP3屬于細(xì)胞凋亡相關(guān)分子，與心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[20]，抑制CASP3有利于防止細(xì)胞凋亡，延緩疾病進(jìn)展。PTGS2編碼產(chǎn)生環(huán)氧合酶-2(COX-2)，抑制COX-2會(huì)導(dǎo)致心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，保護(hù)HSP90AA1有利于缺血-再灌注后心肌細(xì)胞的恢復(fù)[22]。CAT可以有效抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活時(shí)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，過表達(dá)時(shí)可以抵抗缺血-再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[23]。JUN是轉(zhuǎn)錄因子AP-1的主要組成成分，而AP-1同樣介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡[24]。RELA通過翻譯后的泛素化修飾，可以抑制NF-κB炎癥通路[25]。NR3C1為糖皮質(zhì)激素受體基因，容易變異，有研究發(fā)現(xiàn)，該基因的變異與心血管疾病常見的血壓、血脂、血糖等危險(xiǎn)因素相關(guān)[26]。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)多生物過程主要富集于循環(huán)系統(tǒng)。分子功能主要包括蛋白質(zhì)均二聚活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，每種功能富集多個(gè)基因，說明五苓散相關(guān)靶點(diǎn)通過發(fā)揮多種分子功能作用于CHF。KEGG分析結(jié)果顯示，富集的多條通路與心血管疾病關(guān)系密切，每條通路富集多個(gè)基因，五苓散通過調(diào)控相關(guān)通路作用于CHF。AGE-RAGE信號(hào)通路可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)激活NF-κB通路，引起異常炎癥反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)引起細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等基因的轉(zhuǎn)錄，易導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[27]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17通過AP-1上調(diào)存在于心肌細(xì)胞中趨化因子C-C基序配體2(CCL2)的表達(dá)，加速了心肌損傷[28]。IL-17激活NF-κB信號(hào)通路[29]等多種炎癥通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[30]。研究表明，TNF-α導(dǎo)致左心室重塑，同時(shí)激活炎癥通路，與心肌炎、心力衰竭多種心臟疾病相關(guān)[10]，因此，調(diào)控TNF相關(guān)通路對(duì)心力衰竭的治療有一定影響[31]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，激活cGMP-PKG信號(hào)通路可以減輕心肌損傷，抑制炎癥反應(yīng)[32]。心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)可以介導(dǎo)鈣信號(hào)通路，有效防止心律失常，起到保護(hù)心臟的作用[33]。

分子對(duì)接結(jié)果中，參與對(duì)接的主要藥物成分與相關(guān)靶標(biāo)有良好的對(duì)接，尤其是谷甾醇(sitosterol)、麥角甾-5，7，22-三烯-3-醇(ergosta-5，7，22-trien-3-ol)、麥角甾-7，22-二烯-3β-ol(ergosta-7，22-diene-3β-ol)與NOS3和PTGS2的結(jié)合力較為顯著，且與陽(yáng)性對(duì)照藥物托伐普坦接近。托伐普坦對(duì)CHF液體潴留和利尿劑抵抗有效，并且有臨床試驗(yàn)表明治療后病人血清TNF-α、ICAM-1等炎癥分子水平降低[34]。因此，本研究結(jié)果為五苓散用于CHF利尿劑抵抗病人提供了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)依據(jù)。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析五苓散治療CHF的作用機(jī)制，體現(xiàn)了五苓散藥物多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路作用于疾病的特點(diǎn)，主要以炎癥通路、氧化應(yīng)激、心室重構(gòu)、細(xì)胞凋亡等相關(guān)通路作用于CHF，研究挖掘出的藥物成分與相關(guān)靶點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及新藥的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。