劉嫣含，李廷軒，蒲 勇，高東東，葉代樺*

（1 四川農(nóng)業(yè)大學資源學院,四川成都 611130；2 瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,四川瀘州 646000；3 四川省生態(tài)環(huán)境科學研究院,四川成都 610042）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化學磷肥和有機肥的不合理施用，易導致磷素在農(nóng)田土壤中大量積累，加劇水體富營養(yǎng)化等環(huán)境風險[1–2]。磷引起的非點源污染對我國水體總污染的貢獻高達93%[3]。利用磷富集植物提取介質(zhì)中過量的磷是一種有效的治理方法，目前篩選出的植物如水萵苣[4]、美人蕉[5]和馬唐[6]等均表現(xiàn)出較好的磷素提取效果。良好的磷富集植物應具有較強的磷積累能力，但生長介質(zhì)中磷濃度過高會導致植物生物量大幅下降，限制其實際提取效果[7]。因此，對高磷具有較強耐性是磷富集植物應用于植物修復的重要前提。

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，直接感知逆境脅迫，是植物最敏感的部位[8]。逆境脅迫會打破植物根系細胞活性氧動態(tài)平衡，導致根內(nèi)過氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)過量積累，引發(fā)或加劇根系膜脂過氧化作用[9]。為保護植物根系膜脂完整性，根系抗氧化酶系統(tǒng)會將某些有毒物質(zhì)氧化為無毒物質(zhì)，從而保護根系健康生長[10]。其中超氧化物歧化酶(SOD)可把超氧陰離子自由基分解成O2和H2O2，而過氧化氫酶(CAT)則能進一步把H2O2降解成H2O和O2，過氧化物酶(POD)也具有清除H2O2的功能[11]。除抗氧化酶系統(tǒng)外，植物根系元素亞細胞分布也是影響其耐性的重要指標。將更多元素積累分布于細胞壁和液泡可有效降低元素過量對細胞器的毒害，緩解根系受到的脅迫[12–13]。因此，弄清脅迫環(huán)境下植物根系抗氧化酶系統(tǒng)和元素亞細胞分布的變化，有助于揭示植物根系耐性特征。

前期研究發(fā)現(xiàn)，水陸兩生植物水蓼(Polygonum hydropiper)具有良好的磷富集能力，且礦山生態(tài)型水蓼磷富集能力更強，其對高濃度畜禽廢水中的全磷去除率高達69.10 %[14]。高磷處理下礦山生態(tài)型水蓼生物量和磷積累量均顯著高于非礦山生態(tài)型，根系形態(tài)、根系酸性磷酸酶和植酸酶活性等指標與植株磷積累能力緊密相關[15]。由此可見，高磷環(huán)境下良好的根系發(fā)育是礦山生態(tài)型水蓼磷富集的保障，但其根系對高磷的耐受能力仍不清楚。基于此，本研究以礦山生態(tài)型水蓼為試驗材料，非礦山生態(tài)型水蓼為對照，研究礦山生態(tài)型水蓼根系對高磷的耐受特征，為后期合理利用礦山生態(tài)型水蓼提取環(huán)境中過量的磷提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物：水蓼(Polygonum hydropiper)，礦山生態(tài)型種子采自四川省什邡磷礦區(qū)(104°01′ E，31°25′ N)，非礦山生態(tài)型種子采自四川省都江堰市灌口鎮(zhèn) (103°37′ E，31°02′ N)。

供試肥料：磷酸二氫鉀(KH2PO4)，為分析純。

1.2 試驗設計與處理

試驗設 2、4、8、16 mmol/L 4 個高磷濃度處理，以0.5 mmol/L作為正常磷對照，每處理重復4次，共40盆，完全隨機排列。采用水培試驗，磷源為KH2PO4，營養(yǎng)液為去磷的霍格蘭營養(yǎng)液和阿農(nóng)微量元素混合液。選取均一的種子，經(jīng)10%的H2O2消毒30 min后，洗凈，于40℃培養(yǎng)箱中浸種8 h后，盛于裝有珍珠巖和蛭石的塑料盤萌發(fā)。待種子萌發(fā)后，從培養(yǎng)箱中取出進行常規(guī)管理。于三葉期時澆灌1/2營養(yǎng)液至株高約8 cm，選擇長勢一致的幼苗移至黑色塑料盆(3 L)中，先用1/2霍格蘭營養(yǎng)液預培養(yǎng)2周。隨后移入相應磷處理的完全營養(yǎng)液(K用K2SO4進行平衡)的黑色塑料盆(容積3 L)，每盆3株。每3～4天更換一次營養(yǎng)液，并使用0.1 mol/L的H2SO4或NaOH調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH至5～6，采用自然光照。試驗于2020年3月至6月在四川農(nóng)業(yè)大學科研園區(qū)有防雨設施的網(wǎng)室中進行。

1.3 樣品采集與制備

于處理后第3周采集植株根系樣品，植株根系先用自來水沖洗再用蒸餾水潤洗。將每株根系樣品均勻分為3部分，一部分于75℃烘干至恒重，稱重，粉碎后過1 mm篩用于測定根系生物量和磷含量；另一部分經(jīng)液氮速凍后保存于–75℃超低溫冰箱中，用于根系H2O2含量、MDA含量、抗氧化酶活性和亞細胞各組分磷含量的測定；最后一部分立即浸泡在福爾馬林–冰醋酸–酒精固定液(FAA)中，用于植物根系膜透性的研究。

1.4 測定項目及方法

根系磷含量采用HNO3微波消解—釩鉬黃比色法測定[16]；根系質(zhì)膜完整性檢驗采用Evans blue方法染色，后在光學顯微鏡下觀察拍照[17]；根系MDA含量參照Dhindsa等的方法測定[18]；根系H2O2含量采用南京建成生產(chǎn)的過氧化物試劑盒測定；根系抗氧化酶含量采用索萊寶生產(chǎn)的SOD、POD和CAT活性檢測試劑盒測定；根系亞細胞組分磷含量采用鉬銻抗比色法測定[16]。

根系亞細胞組分分離采用差速離心法，準確稱取鮮樣 0.100 g，加入 10 mL 提取液 [0.25 mol/L 蔗糖+50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.5)+1 mmol/L 二硫赤鮮糖醇]，液氮研磨成勻漿。勻漿液在冷凍離心機(4℃) 300 r/min 下離心 1 min，沉淀為細胞壁組分；上清液在10000 r/min下離心20 min，沉淀為細胞器組分；最終上清液為包含細胞質(zhì)和液泡的可溶部分[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，選擇LSD法進行多重比較，用 Excel 2019、Image-Pro Plus 6.0和Origin 9.0進行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 高磷對水蓼生物量的影響

由圖1可知，隨著磷濃度的增加，礦山生態(tài)型水蓼地上部和根系生物量均先增加后降低，在磷濃度4 mmol/L時達到最大值，分別為對照的1.60和1.27倍；非礦山生態(tài)型水蓼則逐漸下降。高磷處理下，礦山生態(tài)型水蓼地上部和根系生物量均顯著大于非礦山生態(tài)型，分別為其1.35～2.56和1.18～1.86倍。表明礦山生態(tài)型水蓼對高磷的耐受能力更強。

圖1 高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼地上部和根系生物量的變化Fig. 1 Changes in shoot and root biomass of two P. hydropiper ecotypes under high P supply

2.2 高磷對水蓼磷積累的影響

2.2.1 磷含量 由圖2可知，隨著磷濃度的增加，兩種生態(tài)型水蓼地上部和根系磷含量均先增加后保持穩(wěn)定。高磷處理下，兩種生態(tài)型水蓼根系磷含量均顯著高于對照，其地上部磷含量在除2 mmol/L磷濃度處理外也均較對照顯著增加。高磷處理下，水蓼地上部和根系磷含量在生態(tài)型間差異不顯著。

圖2 高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼地上部和根系磷含量的變化Fig. 2 Changes in shoot P and root P content of two P. hydropiper ecotypes under high P supply

2.2.2 磷積累量 由圖3可知，隨著磷濃度的增加，礦山生態(tài)型水蓼地上部磷積累量先增加后降低，在磷濃度4 mmol/L時達到最大值；非礦山生態(tài)型水蓼地上部磷積累量無明顯變化。隨著磷濃度的增加，兩種生態(tài)型水蓼根系磷積累量均先增加后降低，分別在磷濃度4和2 mmol/L時達到最大值。與對照相比，除16 mmol/L磷濃度處理外，高磷顯著提高了礦山生態(tài)型水蓼根系磷積累量，非礦山生態(tài)型根系磷積累量僅在2 mmol/L磷濃度處理時較對照顯著增加。除16 mmol/L磷濃度處理地上部磷積累量外，礦山生態(tài)型水蓼地上部和根系磷積累量在高磷處理下均顯著高于非礦山生態(tài)型，分別為其1.35～2.58和1.36～1.96倍?？梢姡V山生態(tài)型水蓼對磷的積累能力更強。

圖3 高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼地上部和根系磷積累量的變化Fig. 3 Changes in shoot P and root P accumulation of two P. hydropiper ecotypes under high P supply

2.3 高磷處理下水蓼根系氧化損傷程度分析

2.3.1 根系質(zhì)膜完整性 伊文斯藍染色主要用于評價細胞膜系統(tǒng)的完整性或通透性，根系被藍色著色越明顯，代表其質(zhì)膜受損越嚴重。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，隨著磷濃度的增加，兩種生態(tài)型水蓼根系染色均逐漸加深。磷濃度達到8 mmol/L時，礦山生態(tài)型水蓼根系染色明顯，根系質(zhì)膜受到明顯損傷；磷濃度大于2 mmol/L時，非礦山生態(tài)型水蓼根系質(zhì)膜均受到明顯損傷。可見，礦山生態(tài)型水蓼根系耐受磷濃度更高。

圖4 高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼根系膜透性的變化Fig. 4 Changes in apical membrane permeability of the roots of two P. hydropiper ecotypes under high P supply

2.3.2 根系過氧化氫及丙二醛含量 由圖5可知，隨著磷濃度的增加，礦山生態(tài)型水蓼根系H2O2含量先保持穩(wěn)定后顯著增加，而非礦山生態(tài)型H2O2含量則逐漸增加。高磷處理下礦山生態(tài)型水蓼根系H2O2含量顯著低于非礦山生態(tài)型，為其45.16%～68.67%。隨著磷濃度的增加，兩種生態(tài)型水蓼根系MDA含量均先保持穩(wěn)定后顯著增加，在16 mmol/L磷濃度處理時達到最大值。在磷濃度8和16 mmol/L時，礦山生態(tài)型水蓼根系MDA含量顯著低于非礦山生態(tài)型，為其78.13%～78.37%。結(jié)果表明，礦山生態(tài)型水蓼根系H2O2及MDA含量更低。

圖5 高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼根系過氧化氫和丙二醛含量的變化Fig. 5 Changes in H2O2 and MDA content in the roots of two P. hydropiper ecotypes under high P supply

2.4 高磷對水蓼根系抗氧化酶活性的影響

隨著磷濃度的增加，兩種生態(tài)型水蓼根系SOD、POD和CAT活性均呈現(xiàn)先顯著增高后降低的趨勢(圖6)。在16 mmol/L磷濃度處理時，礦山生態(tài)型水蓼根系僅CAT活性顯著低于對照，而非礦山生態(tài)型根系SOD和CAT活性均顯著低于對照。在磷濃度4和8 mmol/L時，礦山生態(tài)型水蓼根系SOD活性顯著高于非礦山生態(tài)型，分別為其1.31和1.40倍。除磷濃度16 mmol/L外，高磷處理下礦山生態(tài)型水蓼根系POD和CAT活性均顯著高于非礦山生態(tài)型。以上結(jié)果表明，礦山生態(tài)型水蓼根系抗氧化酶活性更高，可有效減緩細胞脂質(zhì)過氧化，維持其細胞膜穩(wěn)定性。

圖6 高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼根系SOD、POD和CAT活性的變化Fig. 6 Changes in SOD,POD,and CAT activities of the roots of two P. hydropiper ecotypes under high P supply

2.5 高磷對水蓼根系亞細胞組分磷分布特征的影響

2.5.1 根系各亞細胞組分磷含量 由圖7可知，隨著磷濃度的增加，兩種生態(tài)型水蓼根系細胞壁、可溶部分和細胞器磷含量顯著增加，均在磷濃度16 mmol/L時達到最大值。在各高磷濃度下，礦山生態(tài)型水蓼根系可溶部分磷含量均顯著高于非礦山生態(tài)型，為其1.03～1.12倍；其細胞壁和細胞器磷含量分別在磷濃度2、8和8、16 mmol/L時顯著高于非礦山生態(tài)型。

圖7 高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼根系細胞壁、可溶部分和細胞器磷含量的變化Fig. 7 Changes in the cell wall,soluble and organelle fractions of P content in subcellular components of the roots of two P. hydropiper ecotypes under high P supply

2.5.2 根系亞細胞組分磷分配比例 兩種生態(tài)型水蓼根系亞細胞組分磷含量均表現(xiàn)為可溶部分＞細胞壁＞細胞器(圖8)。其中礦山生態(tài)型水蓼根系40.79%～43.69 %的磷分配于細胞壁，43.72%～47.15 %的磷分配于可溶部分，僅少量磷分配于細胞器，非礦山生態(tài)型水蓼具有相似性。隨著磷濃度的增加，兩種生態(tài)型水蓼根系可溶部分磷分配比例較對照有明顯增加，在磷濃度2和4 mmol/L時變化趨勢較大。以上表明，高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼根系磷優(yōu)先分配于細胞壁和可溶部分，從而緩解根系受到的磷脅迫。

圖8 高磷處理下兩種生態(tài)型水蓼根系亞細胞組分磷分配比例的變化Fig. 8 Changes in the subcellular component allocation ratio of the roots of two P. hydropiper ecotypes under high P supply

3 討論

植物面臨高磷脅迫時根系感知最為敏感，根系生物量的變化可以反映其耐受能力。張育文等[20]研究發(fā)現(xiàn)，隨供磷濃度的增加辣椒根系生物量先增加后下降，過高磷濃度會抑制其根系生長。本研究中，兩種生態(tài)型水蓼根系生物量在磷濃度8和16 mmol/L時均顯著下降，過高磷濃度對水蓼根系產(chǎn)生了毒害。不同植物對高磷的適應能力不同，高磷處理下Hakea prostrata出現(xiàn)毒害癥狀，而Ptilotus則表現(xiàn)出較好耐受性[12,21]。同時植物不同基因型或生態(tài)型間對高磷的響應也不同，高磷處理下兩種基因型大麥地上部鮮重相近，但突變體大麥根系鮮重比野生型高44 %[22]。本研究中，在磷濃度4 mmol/L時，礦山生態(tài)型水蓼根系生長良好，而非礦山生態(tài)型受到抑制，且高磷處理下礦山生態(tài)型水蓼根系生物量顯著大于非礦山生態(tài)型，說明礦山生態(tài)型水蓼根系對高磷具有更強的耐受能力。高磷同樣會對植物葉片造成毒害，磷富集植物應該對高磷具有良好耐性[12,23]。本研究中，高磷下礦山生態(tài)型水蓼地上部生物量顯著高于非礦山生態(tài)型水蓼，其地上部對高磷也具有較好耐性。除保持較大生物量外，理想的磷富集植物也應具有較強磷富集能力[24-25]。本研究中，礦山生態(tài)型水蓼根系和地上部磷積累量均在磷濃度4 mmol/L時達到峰值，顯著高于非礦山生態(tài)型水蓼，且高于Duo grass[26]、水麻[27]和礦山生態(tài)型粗齒冷水花[28]等磷富集植物，表現(xiàn)出較大的磷提取潛力。

根系氧化損傷程度和抗氧化酶系統(tǒng)與植物耐性密切相關[29]。逆境脅迫下植物會產(chǎn)生大量H2O2和MDA等物質(zhì)，對根系質(zhì)膜和細胞中的許多生物功能分子造成破壞，影響植物正常生長[9,30–31]。低磷脅迫下，番茄根系膜脂損傷程度增加，根系總根長顯著降低，生長受到明顯抑制[32]。本研究中，磷濃度在2和4 mmol/L時，礦山生態(tài)型水蓼根系H2O2和MDA含量相比對照無顯著變化，質(zhì)膜未出現(xiàn)明顯損傷，表現(xiàn)出一定的高磷適應能力。而磷濃度過高同樣會導致礦山生態(tài)型水蓼根系H2O2和MDA大量累積，造成其質(zhì)膜嚴重損傷。逆境下植物根系氧化損傷程度與其抗氧化酶系統(tǒng)密切相關，目前研究中植物抗氧化酶系統(tǒng)主要包括SOD、POD和CAT等[33–34]。研究發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫會啟動杉木幼苗抗氧化酶系統(tǒng)，其體內(nèi)SOD活性的增高可以清除大量的自由基離子[35]。而在對Elodea nuttallii的研究中卻發(fā)現(xiàn)相反結(jié)果，隨著磷濃度的升高，Elodea nuttallii體內(nèi)SOD和CAT活性降低，MDA含量增加，細胞膜脂過氧化加劇[36]。本研究中，磷濃度在2和4 mmol/L時礦山生態(tài)型水蓼根系抗氧化酶活性顯著高于對照，而磷濃度在高于8 mmol/L后則與對照差異減小，甚至CAT活性在磷濃度16 mmol/L時較對照顯著降低。表明高磷誘導礦山生態(tài)型水蓼根系抗氧化酶活性增高，以清除體內(nèi)多余H2O2和MDA。而磷濃度過高時，其根系H2O2和MDA積累超出自身清理能力，根系生長仍會受到高磷毒害。植物不同基因型或生態(tài)型間根系抗氧化酶系統(tǒng)差異較大。低磷脅迫下，耐低磷苦蕎品種根系SOD和POD活性增幅大于其他品種，根系生長情況更好[37]。本研究中，與非礦山生態(tài)型相比，高磷處理下礦山生態(tài)型水蓼根系抗氧化酶活性更高，是其對高磷具有更強耐受能力的重要原因之一。

植物亞細胞組分元素分布與其耐性緊密相關，有效控制細胞質(zhì)的元素含量，可以維持植物細胞結(jié)構(gòu)的完整性[38–39]。細胞壁是保護原生質(zhì)體免受毒害的第一道屏障，具有豐富的交換性陽離子，能吸附大量的元素[40]。多數(shù)修復植物優(yōu)先將元素固定于其細胞壁表面，從而避免細胞內(nèi)部受到毒害[41–42]。在本研究中，兩種生態(tài)型水蓼細胞壁磷分配比例均較高，這一功能可有效控制細胞可溶性組分和細胞器組分在耐受范圍內(nèi)積累磷素，以減少高磷毒害。當細胞壁吸附能力飽和后，過多的元素會優(yōu)先儲存于可溶部分中，以降低元素對細胞器的毒害[43]。細胞可溶部分由液泡和細胞質(zhì)兩部分組成，磷濃度過高時植物液泡磷含量變幅要大于細胞質(zhì)，液泡是其磷素儲存的重要場所[21]。植物可溶部分的液泡區(qū)隔化可有效避免磷毒害，是植物的重要耐性機制之一，這在磷富集植物澳洲狐尾草[12]和本研究水蓼中均有所發(fā)現(xiàn)。植物液泡區(qū)隔化可能與其液泡膜磷轉(zhuǎn)運蛋白有關，研究發(fā)現(xiàn)當外界磷素缺乏時，液泡儲存的無機磷會被釋放到胞質(zhì)中供植物利用，當外界磷素充足時，植物吸收的大部分無機磷會被儲存在液泡中，液泡膜應具有磷體內(nèi)周轉(zhuǎn)及再利用的調(diào)控機制[44]。目前已在擬南芥液泡膜上發(fā)現(xiàn)無機磷轉(zhuǎn)運蛋白(VPTs，也被稱為PHT5)，其可將無機磷隔離到液泡腔，而高磷處理下水蓼的液泡無機磷轉(zhuǎn)運機制至今仍不清楚，有待在后期研究中進一步探索[45]。綜上所述，細胞壁固持和可溶部分的液泡區(qū)隔化可能是水蓼具有高磷耐性的重要原因。

4 結(jié)論

礦山生態(tài)型水蓼對高磷的耐受能力和磷積累能力均強于非礦山生態(tài)型水蓼。高磷處理下礦山生態(tài)型水蓼有兩個特點：1)自由基和保護酶保持動態(tài)平衡的磷脅迫生理應答機制，通過提高根系抗氧化酶活性，使其根系H2O2和MDA含量保持在較低水平，從而維持質(zhì)膜完整性；2)細胞壁固持和可溶部分的液泡區(qū)隔化的相互協(xié)調(diào)，將磷素優(yōu)先分配于非代謝活性組織，減輕或避免高磷對細胞器的損傷，提高根系對高磷的耐受能力。