辛 宇，邱智東，陳天麗，王偉楠，曲 墨

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

人參被譽(yù)為“百草之王”，是傳統(tǒng)名貴中藥材之一。其主要活性成分為人參皂苷，此外還有有機(jī)酸、揮發(fā)油、氨基酸、甾醇等多種化學(xué)成分[1-4]。作為一種藥用價(jià)值極高的中藥材，人參在醫(yī)藥、保健、飲料、化妝品領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。但人參的生物利用度低并具有溫燥之性，這些特點(diǎn)成為了人參應(yīng)用過程中不可忽視的問題。為了進(jìn)一步擴(kuò)大人參藥材的應(yīng)用范圍，目前對(duì)其的加工方法主要有物理[5-6]、化學(xué)[7]和生物法[8]，這些方法在保存人參藥效，增效減毒，改變藥物性能等方面取得了不同的成效。藥用真菌雙向固體發(fā)酵技術(shù)是將傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代生物技術(shù)的優(yōu)勢(shì)融合，以含有活性成分的中藥材作為發(fā)酵基質(zhì)[9]，發(fā)酵過程中藥用真菌與基質(zhì)相互作用，中藥基質(zhì)為真菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，真菌生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的酶對(duì)藥材中的活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)生新的化學(xué)成分可提高中藥中有效成分的含量，從而達(dá)到增效減毒的目的[10-14]。本研究以人參為發(fā)酵基質(zhì)，利用國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布的可用于保健食品的菌種：冬蟲夏草菌作為發(fā)酵菌株，進(jìn)行雙向固體發(fā)酵。利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面等方法對(duì)人參蟲草發(fā)酵基質(zhì)（參草菌質(zhì)）的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為人參發(fā)酵的后續(xù)研究提供參考和依據(jù)。

1 材料、試劑及儀器

1.1 主要材料 冬蟲夏草菌（cordyceps sinensis）CICC14017：中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心；人參（Panax ginsengC.A.Meyer）：吉林大藥房。

1.2 試劑 葡萄糖（西隴化工股份有限公司，分析純），酵母浸粉（北京奧博星生物技術(shù)有限公司，生化試劑），瓊脂粉（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，生化試劑），蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限公司，生化試劑），磷酸二氫鉀（西隴化工股份有限公司，分析純）。

1.3 主要儀器 CJ-2D 型雙人凈化工作臺(tái)（天津市泰斯特儀器有限公司），LDZX-50KBS壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司），DNP-9102恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），HZP-250 全溫震蕩培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的配制 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[15]：將馬鈴薯去皮后稱取200 g 并切成小塊，加入蒸餾水1.0 L 后煮沸，用六層紗布趁熱濾出濾渣。瓊脂15 g/L，葡萄糖20 g 依次加入濾液中，分裝試管，加塞、包扎，放入121 ℃的高溫高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌23 min，取出放涼后備用。

種子液為優(yōu)化的MBM 培養(yǎng)基：取葡萄糖20 g/L、酵母浸粉8 g/L、蛋白胨12 g/L、MgSO41 g/L、KH2PO40.5 g/L、CaCO30.5 g/L、MnSO40.5 g/L、維生素B110 mg/L，蒸餾水1.0 L，在121 ℃的高溫高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌23 min，冷卻后備用。

2.2 參草菌質(zhì)的制備工藝 將斜面保存的冬蟲夏草菌（cordyceps sinensis）CICC14017接種于種子液培養(yǎng)基，于28 ℃，180r/min 條件下發(fā)酵3 d，將種子液中的菌絲體接種于滅菌放涼后的人參固體培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱，于28 ℃條件下發(fā)酵至冬蟲夏草菌絲形成明顯的菌蕾結(jié)構(gòu)。

2.3 雙向固體發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察人參-冬蟲夏草菌雙向固體發(fā)酵中人參的粉碎粒度（10目、20目、40目、80目、160 目）、人參固體培養(yǎng)基初始含水量（20%、30%、40%、50%、60%）、接菌量（50%、100%、150%、200%、250%）、無(wú)機(jī)鹽種類[16-20]（空白、MnCl2、CuSO4、MgCl2、CaCl2、NaCl）以確定最佳的發(fā)酵工藝。

2.3.2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取藥材粉碎粒度、藥材含水量和CaCl2濃度為因變量，以發(fā)酵周期為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 基質(zhì)粒度對(duì)發(fā)酵周期的影響 隨著人參藥材目粒度的增大，發(fā)酵周期呈先減少再增加的趨勢(shì)。當(dāng)粉碎粒度為80 目時(shí)，發(fā)酵周期最短，為41 d；當(dāng)藥材粉碎目粒度＜80 目時(shí)，藥材與菌絲體接觸不充分，而粉碎粒度＞80 目時(shí)，會(huì)減少培養(yǎng)基中氧氣的流通，導(dǎo)致發(fā)酵周期變長(zhǎng)。所以基質(zhì)粉碎粒度為80 目更合適人參發(fā)酵。見圖1。

圖1 藥材粉碎粒度對(duì)發(fā)酵周期的影響

3.1.2 基質(zhì)含水量對(duì)發(fā)酵周期的影響 隨著人參培養(yǎng)基含水量的增加，發(fā)酵周期呈先減少再增加的趨勢(shì)。當(dāng)含水量為40%時(shí)，發(fā)酵周期最短為39 d，表明向基質(zhì)中加入適量的水有利于冬蟲夏草菌的定殖和代謝，而當(dāng)含水量繼續(xù)增加時(shí)，由于培養(yǎng)基中的水分子使得空氣中濕度增加，阻礙了真菌的有氧呼吸，導(dǎo)致發(fā)酵周期變長(zhǎng)。所以藥材中的含水量為40%比較合適人參發(fā)酵。見圖2。

圖2 基質(zhì)含水量對(duì)發(fā)酵周期的影響

3.1.3 接種量對(duì)發(fā)酵周期的影響 隨著人參基質(zhì)上接種量的增加，發(fā)酵周期逐漸縮短。當(dāng)接種量為200%時(shí)，繼續(xù)增加接菌量，發(fā)酵周期沒有明顯的變化，所以選擇接種量為冬蟲夏草菌絲體濕重與人參固體培養(yǎng)基干重的比例（m:m）=200%更適合人參發(fā)酵。見圖3。

圖3 菌絲體接種量對(duì)發(fā)酵周期的影響

3.1.4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵周期的影響 通過對(duì)比不添加無(wú)機(jī)鹽的空白組，添加CuSO4、NaCl 和MgCl2會(huì)不同程度的增加參草菌質(zhì)的發(fā)酵周期，而無(wú)機(jī)鹽CaCl2和MnCl2的添加則會(huì)減少參草菌質(zhì)的發(fā)酵周期，其中CaCl2促進(jìn)發(fā)酵的效果更為明顯，發(fā)酵周期為34 d，所以篩選出CaCl2作為參草菌質(zhì)固體發(fā)酵的生長(zhǎng)因子。見圖4。

圖4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵周期的影響

3.2 優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

3.2.1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以冬蟲夏草菌絲可觀察到菌蕾結(jié)構(gòu)即為發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵周期（Y）為響應(yīng)值，藥材粉碎粒度（A）、基質(zhì)含水量（B）及CaCl2濃度（C）采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化發(fā)酵條件，根據(jù)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[21]原理。利用Design Expert 10.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合，得到發(fā)酵周期（Y）的二次多元回歸方程為：Y=31.4+8A+9B-10C-0.5AB-2.6AC+8BC+9.6A2-5B2-3.4C2+12.8ABC-7A2B-8.5AB2

此模型的P值=0.002 ＜0.05，極顯著，失擬項(xiàng)P值=0.1234 ＞0.05，不顯著，說明實(shí)驗(yàn)中未考慮的因素對(duì)結(jié)果影響不顯著。決定系數(shù)R2=0.991 6，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.966 6，說明該模型可準(zhǔn)確反應(yīng)各因素對(duì)發(fā)酵周期的影響，模型對(duì)實(shí)際情況擬合良好。一次項(xiàng)B、C及二次項(xiàng)A2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），而其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果不顯著（P＞0.05）。三種因素對(duì)發(fā)酵周期的影響程度排序?yàn)镃aCl2濃度（C）＞基質(zhì)含水量（B）＞藥材粉碎粒度（A）。

3.2.2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 利用Design Expert 10.0 軟件分析得到各因素間交互作用對(duì)人參發(fā)酵周期（Y）的影響，參草菌質(zhì)的發(fā)酵周期會(huì)隨著藥材目粒度的增加而表現(xiàn)出先減少后增加的變化。并且發(fā)酵周期隨著基質(zhì)含水量的增加而逐漸增加，說明在35%～45%的范圍內(nèi)基質(zhì)含水量的增加會(huì)降低發(fā)酵效率。同時(shí)發(fā)酵周期隨著CaCl2的加入逐漸減少，說明在160～200 μmol/g 的范圍內(nèi)CaCl2的加入可以增加參草菌質(zhì)的發(fā)酵效率。響應(yīng)值對(duì)應(yīng)因素的作用程度，CaCl2濃度影響最為顯著，發(fā)酵周期隨CaCl2濃度的變化而顯著變化；基質(zhì)含水量對(duì)發(fā)酵周期的影響較為顯著，但其曲面較CaCl2濃度稍顯平緩；藥材粉碎粒度的曲面較于含水量稍顯平緩，該結(jié)論與回歸模型分析結(jié)果一致，各因素對(duì)發(fā)酵周期的影響程度排序?yàn)镃aCl2濃度＞基質(zhì)含水量＞藥材粉碎粒度。結(jié)果見圖5。

圖5 藥材粉碎粒度、基質(zhì)含水量、CaCl2 加入量交互作用對(duì)發(fā)酵周期的響應(yīng)面及等高線

對(duì)二次多元回歸方程求解，得到參草菌質(zhì)最優(yōu)發(fā)酵工藝為：藥材粉碎粒度80 目，基質(zhì)含水量為28%，CaCl2的加入量為206 μmol/g，得出的最優(yōu)理論發(fā)酵周期為25 d。

3.2.3 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取人參藥材，按優(yōu)化后的工藝進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到的平均發(fā)酵周期為27 d。工藝驗(yàn)證結(jié)果與理論計(jì)算的25 d 存在些許差異，但已小于響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組中最短的發(fā)酵周期，所以利用響應(yīng)面法優(yōu)化的參草菌質(zhì)發(fā)酵工藝條件準(zhǔn)確合理，應(yīng)用價(jià)值較大。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)分別考察人參粉碎粒度、基質(zhì)初始含水量、接菌量、無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)冬蟲夏草菌發(fā)酵人參發(fā)酵周期的影響，進(jìn)而采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并利用響應(yīng)曲面法對(duì)核心發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證出冬蟲夏草菌固體發(fā)酵人參的最佳工藝，極大的縮短了發(fā)酵周期，證明該技術(shù)在中藥固體發(fā)酵工藝優(yōu)化過程中的可行性，同時(shí)也為后續(xù)發(fā)酵人參的系統(tǒng)研究與開發(fā)提供了穩(wěn)定的原料輸出，為新穎中藥化學(xué)成分的挖掘奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。