王志華 劉鑫惠 李晶 段紅年 馬江濤 王丹 齊欣 李保馳

肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)是引起兒童社區(qū)獲得性肺炎常見的病原體，肺炎支原體感染約占需要住院小兒肺炎患者的20%，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、肺部啰音等癥狀，甚至可引起與免疫反應(yīng)性損傷相關(guān)的各種神經(jīng)并發(fā)癥(例如，無菌性腦膜炎、橫貫性脊髓炎、腦病等)[1]。姜黃素(curcumin，Cur) 是一種從姜科植物根莖中提純的，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗老化等藥理作用的多酚類化合物[2]。姜黃素可直接或間接地調(diào)控各種炎癥細(xì)胞因子(如環(huán)氧化酶、白介素、腫瘤壞死因子等) 和重要的炎癥反應(yīng)通路(如NF-κB等)，核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)與先天和適應(yīng)性免疫以及炎癥有關(guān)的許多基因的表達(dá)[3]。NF-κB蛋白家族RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB (p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)五種亞基，任意兩個(gè)亞基都可形成同源或異源二聚體，其中 p65/p50異源二聚體的活性最高且最常見[4]。另外，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a，TNF-α)是臨床中常用來反映肺炎支原體感染炎癥情況的指標(biāo)[5]。故本研究基于NF-κB p65途徑探討姜黃素對肺炎支原體感染肺炎幼鼠癥狀的改善以及使用IL-6、IL-8和TNF-α探討姜黃素的抑炎作用。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只SPF級4周齡BALB/c雌性小鼠，質(zhì)量為18～22g。按照SPF級小鼠飼養(yǎng)方式喂養(yǎng)，適應(yīng)一周后正式實(shí)驗(yàn)。BALB/c雌性小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號為維通利華SCXK(京)2016-0006。本研究已獲院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、儀器與試劑

MP國際標(biāo)準(zhǔn)株購自首都兒科研究所；NF-κB p65(兔多抗)、β-actin和抗兔抗山羊二抗，均購于美國Santa Cruz公司；IL-6、IL-8和TNF-α ELISA試劑盒均購于瑞士Roche公司；RIPA、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF均購自北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛(分析純)、乙醚(分析純)、乙醇(分析純)、甲醇(分析純)均購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1 動(dòng)物分組及模型的建立：選取50只SPF級 BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為五組，每組10只，分別為空白對照組(A組)、模型組(B組)、姜黃素高劑量組(C組)，姜黃素中劑量組(D組)和姜黃素低劑量組(E組)，模型組及姜黃素治療組采用滴鼻法進(jìn)行MP感染?？瞻讓φ战M(A組)：不做任何處理正常飼養(yǎng)；模型組(B組)：用乙醚將小鼠輕度麻醉后，滴鼻接種50 μL濃度為1×107CCU/mL MP菌液，連續(xù)滴鼻3天[6]；姜黃素高劑量組(C組)：連續(xù)滴鼻3天MP菌液模型后，灌胃給予200 mg/kg量的姜黃素，每日一次，連續(xù)7天；黃素中劑量組(E組)：連續(xù)滴鼻3天MP菌液模型后，灌胃給予100 mg/kg量的姜黃素，每日一次，連續(xù)7天；姜黃素低劑量組(F組)：連續(xù)滴鼻3天MP菌液模型后，灌胃給予50 mg/kg量的姜黃素，每日一次，連續(xù)7天。

2 HE染色：模型后第7天，使用400 mg/kg劑量的10%水合氯醛，腹腔注射麻醉小鼠，取小鼠肺部組織，置于福爾馬林固定液中固定3天，石蠟包埋，制作厚度為5 μm的石蠟切片，使用蘇木精-伊紅染色(HE染色)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察組織。

3 免疫組化染色測定肺組織表達(dá)的NF-κB陽性細(xì)胞的積分光密度：石蠟切片脫蠟，PBS緩沖液清洗，加血清封閉，PBS緩沖液清洗，加NF-κB一抗4℃過夜，依次加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，光鏡下細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)的棕黃色物質(zhì)為陽性反應(yīng)。利用圖像分析管理系統(tǒng)對免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行圖像分析，測定NF-κB陽性細(xì)胞的積分光密度(integral optical density，IOD)。

4 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測肺組織中NF-κB蛋白：使用400 mg/kg劑量的10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，取出小鼠肺組織超聲粉碎，再加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液(40 uL RIPA+5 uL蛋白酶抑制劑+5 uL磷酸酶抑制劑+0.5 uL PMSF)提取蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量；高溫使蛋白變性，然后上樣25μL、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；加入NF-κB一抗4℃過夜孵育，使用TBST洗滌3次，加二抗孵育1h，使用TBST洗膜3次﹐曝光，凝膠成像系統(tǒng)成像，定量分析。

5 ELISA法檢測IL-6、IL-8和TNF-α水平：使用400 mg/kg劑量的10%水合氯醛腔注射麻醉小鼠，使用4℃預(yù)冷的PBS溶液灌洗支氣管，收集灌洗液，4℃離心后取上清，并按照ELISA試劑盒說明書對IL-6、IL-8和TNF-α進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-6、IL-8和TNF-α的濃度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、肺組織病理學(xué)變化

光鏡下觀察，空白對照組(圖1 A組)小鼠肺泡結(jié)構(gòu)比較完整，肺泡間隔薄，肺泡腔內(nèi)無炎性滲出物；模型組(圖1 B組)小鼠肺組織病理改變明顯，肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔伴有炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔充血增厚；姜黃素高劑量組(圖1 C組)小鼠肺組織與模型組(圖1 B組)比，小鼠肺泡結(jié)構(gòu)比較完整，肺泡與氣管結(jié)構(gòu)清晰，炎細(xì)胞明顯減少，姜黃素中劑量組(圖1 D組)對小鼠有一定的治療效果，但肺泡壁仍呈現(xiàn)充血增厚的狀態(tài)；姜黃素低劑量組(圖1 E組)小鼠和模型組小鼠比較并無明顯差異，仍存在大量炎性滲出物，且器官和肺泡結(jié)構(gòu)有明顯損傷。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)(HE，×400)

二、免疫組化染色測定肺組織NF-κB p65的IOD值

免疫組化染色結(jié)果顯示，肺組織中 NF-κB p65陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕褐色的顆粒，模型組(B組)小鼠肺組織中細(xì)胞漿及胞核內(nèi)，觀察到分布均勻的棕色顆粒, 且明顯多于空白對照組(A組)，大多數(shù)位于細(xì)胞核。五組間肺組織NF-κB p65的IOD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：與模型組(B組)小鼠相比，姜黃素高劑量組(C組)和姜黃素中劑量組(D組)可降低小鼠肺組織中 NF-κB p65的IOD值(P<0.01)；姜黃素低劑量組(E組)小鼠肺組織中NF-κB p65 IOD值與模型組(B組)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果(見圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織NF-κB(p65)蛋白免疫組化積分密度值

三、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況

Western blot以β-actin為內(nèi)參，五組間肺組織NF-κB p65蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：模型組(B組)小鼠肺組織NF-κB蛋白表達(dá)較空白對照組(A組)明顯升高(P<0.01 )，與模型組(B組)小鼠相比，姜黃素高劑量組(C組)和姜黃素中劑量組(D組)肺組織NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01 )；姜黃素低劑量組(E組)與模型組(B組)相比，肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)結(jié)果(見圖3)。

圖3 各組小鼠肺組織NF-κB p65蛋白表達(dá)量

四、 ELISA法檢測IL-6、IL-8和TNF-α水平

五組間肺組織IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：與空白對照組(A組)相比，模型組(B組)小鼠支氣管灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)明顯升高(P<0.01 )，與模型組(B組)小鼠相比，姜黃素高劑量組(C組)和姜黃素中劑量組(D組)支氣管灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)明顯降低(P<0.01 )；姜黃素低劑量組(E組)支氣管灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)與模型組(B組)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠支氣管灌洗液中IL-6和TNF-α的表達(dá)情況

討 論

肺炎支原體感染上呼吸道和下呼吸道，能引起肺炎、支氣管炎和哮喘，除了肺部感染外，它幾乎可以影響每個(gè)器官，包括皮膚和神經(jīng)、血液、心血管和肌肉骨骼系統(tǒng)[7]。由于近年來治療肺炎支原體感染的抗生素耐藥性增加，需尋找新的藥物對肺支原體感染進(jìn)行治療。姜黃素是在姜科植物根莖中提取的多酚類化合物，姜黃由于其抗氧化、抗炎、抗誘變、抗微生物和抗癌的特性在亞洲國家已有數(shù)千年的使用歷史[8]。姜黃素可誘導(dǎo)各種炎癥細(xì)胞因子(如IL-6、IL-8和TNF-α等) 和炎癥反應(yīng)通路(如NF-κB等)下調(diào)從而改善病癥[9]。故本研究通過NF-κB p65探討姜黃素對肺炎支原體感染幼鼠癥狀的改善作用，通過IL-6、IL-8和TNF-α的調(diào)節(jié)來探討姜黃素的抑炎作用。

本研究中，姜黃素高劑量組干預(yù)后，小鼠的肺部病理得到明顯改善，小鼠肺泡結(jié)構(gòu)比較完整，肺泡與氣管結(jié)構(gòu)清晰，炎細(xì)胞明顯減少，說明姜黃素對于肺炎支原體感染小鼠癥狀具有明顯的改善。肺部支原體感染后，NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著增高，NF-κB在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是炎癥反應(yīng)通路的重要樞紐，其介導(dǎo)的相關(guān)因子均在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用[10]。本研究中，姜黃素高劑量組和中劑量組干預(yù)后，NF-κB p65的IOD值和NF-κB p65蛋白表達(dá)量均降低，表明姜黃素高劑量組和中劑量組提高了肺支原體感染肺炎小鼠肺組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)量，進(jìn)一步說明姜黃素高劑量組和中劑量組對于治療肺支原體感染肺炎小鼠有明顯的作用。

有研究表明，IL-6、IL-8和TNF-α的顯著升高與肺支原體感染的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)[11]。IL-6在調(diào)節(jié)免疫功能中起重要作用，其參與肺支原體感染的發(fā)生發(fā)展過程，并在肺支原體感染的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，另外，IL-6與肺支原體感染的嚴(yán)重程度有關(guān)，IL-6在肺支原體感染急性期，可促進(jìn)T細(xì)胞分化并釋放炎性細(xì)胞因子, 使其表達(dá)水平明顯升高[12]。IL-8是一種主要由中性粒細(xì)胞﹑肺泡巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的前炎癥介質(zhì)，且肺支原體感染患者中IL-8顯著高于健康人[13]。TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有生物學(xué)活性的多功能肽，是機(jī)體重要的內(nèi)源性炎性細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面起重要作用。肺支原體感染患兒的TNF-α表達(dá)水平明顯高于健康患兒，其機(jī)制是在肺支原體感染后增加免疫細(xì)胞(如單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)和粘附受體中TNF-α的水平[14]。本研究中，姜黃素高劑量組和姜黃素中劑量組，支氣管灌洗液中IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)明顯降低，說明姜黃素高劑量組和中劑量組對于抑制肺支原體感染小鼠的炎性因子有明顯作用，從而說明姜黃素具有一定的抑炎作用。

綜上所述，姜黃素可改善肺炎支原體感染幼鼠癥狀且能夠抑制炎癥因子，其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB通路的激活，表明姜黃素可作為治療肺炎支原體感染的潛在藥物，但本課題未深入研究姜黃素抑制NF-κB通路的機(jī)制及其調(diào)控的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和調(diào)控基因，因此我們將進(jìn)一步研究姜黃素對肺炎支原體感染肺炎幼鼠抗炎作用及其機(jī)制。