沈 泓，張 櫻，張 軒，姚棟萍,2,3，賀榮華，陳 哲，張 柳，柏 斌,3

（1. 湖南雜交水稻研究中心，雜交水稻國家重點實驗室，湖南 長沙 410125；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，湖南 長沙 410128；3. 國家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410125；4. 湖南省永州市寧遠縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 永州 425699）

土壤鹽漬化是一個全球性生態(tài)問題，也是當今世界耕地退化和土地荒漠化的主要原因之一。我國土壤鹽漬化具有面積大、分布廣、類型多的特點。據(jù)統(tǒng)計，我國鹽堿土壤面積達1億hm2，且呈不斷加重趨勢[1]。在不同的生長發(fā)育時期，水稻對土壤鹽堿的耐受程度不同，其中幼苗期對鹽脅迫最為敏感[2]。鹽堿地種稻是一項“寓改良于利用”的技術(shù)，不僅能有效利用鹽堿地提高糧食產(chǎn)量，而且可以通過水稻根系所分泌的有機酸減輕土壤的鹽堿化程度，起到土壤改良作用[3]。雖然目前已有海水稻等耐鹽水稻品種的相關報道，也有許多關于鹽脅迫對水稻種子萌發(fā)與幼苗根系生長影響及其作用機理的研究，但是植物激素對水稻耐鹽調(diào)控的相關研究尚不多見。

在鹽脅迫下水稻植株首先表現(xiàn)出各種生長發(fā)育過程受阻[4]，其危害機理通常為滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫[5]，而植株耐鹽生理調(diào)節(jié)機制主要包括滲透調(diào)節(jié)、養(yǎng)分調(diào)節(jié)、抗氧化調(diào)節(jié)和激素調(diào)節(jié)，其中植物內(nèi)源激素發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，主要有3種內(nèi)源激素參與水稻的鹽脅迫調(diào)控。一是水楊酸（Salicylic acid，SA）。鹽脅迫條件下，水楊酸可通過誘導抗氧化防御系統(tǒng)或增強抗氧化能力，緩解膜脂過氧化的傷害，并通過降低質(zhì)膜通透性改善細胞的代謝，調(diào)控離子吸收與分布，緩解鹽脅迫的壓力[6-7]。二是脫落酸（Abscisic acid，ABA）。在鹽脅迫條件下，ABA可誘導植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸（Pro）大量積累，緩解鹽分過高造成的滲透脅迫和離子毒害，維持水分平衡[8]，并提高相關保護性酶的活性[9]，從而減輕植物的鹽害。三是茉莉酸（Jasmonic acid，JA）。該內(nèi)源激素與ABA結(jié)構(gòu)相似[10]，也是一種防衛(wèi)信號分子，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導調(diào)控氣孔的閉合，以削弱蒸騰作用進而減少水分的散失[11]。

植物內(nèi)源激素的含量很低，通常在10-6~10-9g之間[12]；且性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解或?qū)χ車h(huán)境和介質(zhì)溫度敏感[13]；加之植物機體構(gòu)成復雜，粗提液中往往含有大量基質(zhì)，使得植物激素的測定分析容易受到干擾[14]。因此，檢測植物激素時，操作必須簡便、快速，儀器必須靈敏、專一。目前，植物激素主要采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定，可分為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-ESI-MS/MS）。GC-MS雖然在靈敏度問題上能滿足植物激素的測定要求，但對樣品的純化要求很高，樣品需要進行衍生化處理，使樣品前處理步驟變得更加繁瑣[15]。而HPLC-MS/MS不僅具有靈敏度高和選擇性好的特點，且該方法不需要對樣品進行繁瑣的衍生化處理，操作步驟簡化，檢測效率較高，適用于熱穩(wěn)定化合物、極性化合物等物質(zhì)的測定。因此，普遍采用HPLC-MS/MS法測定植物激素[16]。但是目前有關鹽脅迫下植物激素含量變化的研究報道較少，且無法精準定量檢測植物內(nèi)源激素含量變化。筆者改進了NY/T 2871—2015[17]中水稻植物激素的檢測方法，使檢測方法的準確度與精確度更高，以便更精準地分析植物內(nèi)源激素含量的變化。研究比較了不同水稻品種在相同鹽脅迫下茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）3種植物激素含量的變化，初步探討了水稻耐鹽能力與植物激素的關聯(lián)性，從而明確對水稻耐鹽能力起關鍵作用的植物內(nèi)源激素，為今后通過調(diào)節(jié)激素水平提高水稻耐鹽能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種有耐鹽品種超優(yōu)千號、Y兩優(yōu)900以及鹽敏感品種IR64，均由湖南雜交水稻研究中心 提供。

主要試驗試劑有Yoshida水稻營養(yǎng)液（Coolaber公司）、HPLC甲醇（Merck公司）、HPLC甲酸（科密 歐）、甲酸銨（Sigma-Aldrich）、純水（Waters蒸餾水）。茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）的標準品均來自sigma-aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

主要儀器設備有三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（SHIMADZU LCMS-8060）、C18色譜柱（Shim-pack GIST-HP 2.1 mm×50 mm，3 μm）、分析天平（Mettler toledo）、渦旋振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）、臺式超速冷凍離心機（德國Eppendorf）、移液槍（德國Eppendorf）、氮吹儀（上海錦文儀器設備有限公司）、混合型陰離子交換固相萃取柱（上海安譜實驗科技儀器有限公司）、超低溫冰箱（三洋冷鏈公司）、冰箱（青島海爾股份有限公司）、超純水設備（萊特萊德純水設備技術(shù)有限公司）、光照培養(yǎng)箱（韶關市廣智科技設備有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準品溶液配制精確稱取各植物激素標準品適量，用甲醇溶解制成濃度為1000 μg/mL標準儲備液；分別吸取一定量的3種植物激素標準儲備液，用甲醇制成濃度為1 μg/mL的混合標準儲備液；分別吸取一定量的混合標準儲備液，用80%甲醇水制成濃度為0.5~100 μg/L的植物激素混合標準工作液。

1.2.2 水稻幼苗培養(yǎng)取3個品種的水稻種子各約200粒，在50℃烘箱中處理3 d后置于35℃、光照強度兩級的光照培養(yǎng)箱中浸泡至露白；待種子發(fā)芽后，放入96孔板，每孔放置一顆發(fā)芽種子，將96孔板放入盛有純水的托盤內(nèi)，蓋上保鮮膜，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待幼苗的主根長至2~3 cm時（一般3~4 d），將托盤內(nèi)的純水改為1/2 Yoshida培養(yǎng)液（pH值5.5），并轉(zhuǎn)移到人工氣候室進行培養(yǎng)；培養(yǎng)6 d后，將1/2培養(yǎng)液改為全培養(yǎng)液（pH值5.5）；注意每3 d更換一次培養(yǎng)液，并確保培養(yǎng)液體積不變。人工氣候室的培養(yǎng)條件：光照時間14 h，溫度（25±4）℃；黑暗時間10 h，溫度（20±2）℃；光照強度為240~350 μmol/(m2·s）；相對濕度為60%~70%。每個品種設置試驗組和對照組。

1.2.3 苗期鹽處理待幼苗長至3葉一心時更換新的全培養(yǎng)液，加入濃度0.8%的NaCl進行鹽處理。每周更換一次全培養(yǎng)液，并且重新加入相應濃度的鹽，確保鹽濃度的穩(wěn)定。期間注意觀察水稻幼苗的形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.2.4 樣品采集及前處理（1）樣品采集：分別采集鹽脅迫0（對照組）、6、24和72 h的水稻幼苗樣品，采樣時將莖葉與根分開，用錫箔紙包好，做好標記后于－80℃冰箱中避光保存。（2）樣品前處理：研缽預冷，將莖葉放入研缽中，加入液氮研磨，稱取0.1 g試樣（精確到0.1 mg）于2 mL塑料離心管中，加入1 mL預冷（4℃）的80%甲醇水，置于4℃冰箱中浸提16 h，期間振搖2~3次；取出，于4℃下13000 r/min離心15 min后，傾出上清液；往殘渣中再次加入1 mL 80%甲醇水，漩渦振蕩，按上述條件離心，合并2次提取液于10 mL容量瓶中，加入2 mL 80%甲醇水后用水稀釋至刻度線，混勻；移取4.00 mL上述提取液過混合性陰離子交換固相萃取柱（使用前需活化），依次用2 mL純水和2 mL甲醇淋洗，用2 mL 1%甲酸甲醇溶液洗脫2次，用5 mL離心管收集洗脫液，并于50℃下氮吹干，加水稀釋至0.5 mL，漩渦混勻，濾膜過濾，待測。

1.2.5 檢測方法優(yōu)化（1）色譜條件：Shim-pack GIST-HP C18（2.1 mm×50 mm，3 μm）色譜柱；設置2種流動相A，一是5 mmol/L甲酸銨，二是5 mmol/L甲酸銨-0.02%甲酸溶液，考察哪種溶液更適合作為流動相A；流動相B為甲醇；流速0.4 mL/min；進樣體積5 μL；柱溫40℃；梯度洗脫程序0~6 min 20%~90% B、6~8 min 90% B、8~8.1 min 90%~20% B、8.1~13 min 20% B。（2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源負離子模式（ESI-）；離子源接口電壓3.0 kV；離子源溫度300℃；脫溶劑管溫度526℃；加熱模塊溫度400℃；霧化氣為氮氣，3.0 L/min；干燥氣為氮氣，10.0 L/min；碰撞氣為氬氣；檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）。優(yōu)化后，3種植物激素的MRM參數(shù)見表1。

表1 優(yōu)化后的MRM參數(shù)

1.2.6 方法學考察（1）線性關系、檢出限及定量限：將0.5、1、5、10、25、50和100 μg/L的系列混合標準溶液進行HPLC-MS測定，每個樣進3針，以濃度 （μg/L）為橫坐標、峰面積為縱坐標制作標準曲線，進行線性回歸分析；并通過信噪比S/N=3和S/N=10計算得出方法的檢出限（LOD）與定量限（LOQ）。（2）精密度：以5、50和100 μg/L這3種濃度水平的混合標準溶液在優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件下按順序連續(xù)進樣5次，通過計算3種植物激素的保留時間和峰面積的相對標準偏差（RSD，%）來衡量精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 同時測定3種植物激素的方法優(yōu)化

與NY/T 2871—2015中的方法相比，該研究的優(yōu)化在于：（1）將樣品減少為0.1 g，使用較小的離心管，讓提取液與樣品充分接觸；（2）將氮吹步驟的吹至“近干”改為“全干”，以改善誤差問題；（3）將原來的流動相A 5 mmol/L甲酸銨溶液改為5 mmol/L甲酸銨-0.02%甲酸溶液。如圖1所示，當以5 mmol/L甲酸銨溶液為流動相A時，SA、JA和ABA 3種植物激素的峰分離效果不佳，而以5 mmol/L甲酸銨-0.02%甲酸溶液為流動相A時，3種植物激素之間的分離度較好，各激素基線之間沒有重疊。由此表明，該檢測方法可同時進行SA、JA和ABA 3種植物激素的檢測。

圖1 采用不同流動相獲得的色譜圖

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系、檢出限及定量限從表2中可以看出，3種植物激素在所選的濃度范圍內(nèi)與其峰面積都呈現(xiàn)出良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）均大于0.999；該檢測方法的靈敏度較高，檢出限在0.02~0.08 μg/L之間，定量限在0.07~0.25 μg/L之間。

表2 3種植物激素的線性關系、檢出限和定量限

2.2.2 精密度由表3可知，3種植物激素的保留時間相對標準偏差在0.100%~0.194%之間，峰面積相對標 準偏差在0.286%~3.125%之間，表明儀器精密度較優(yōu)。

表3 3種植物激素保留時間和峰面積的重復性結(jié)果（n=5）

2.3 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗的形態(tài)表現(xiàn)

3個供試水稻品種在不同鹽處理時間下的生長狀況如圖2所示。在鹽處理之前，耐鹽品種Y兩優(yōu)900、超優(yōu)千號與鹽敏感品種IR64的水稻苗期長勢不同，耐鹽品種株型挺拔，而鹽敏感品種葉片披散，株高相對矮小。經(jīng)鹽處理6 h后，2個耐鹽品種并無明顯 變化，而IR64經(jīng)鹽處理6 h后部分葉尖已經(jīng)開始泛黃并出現(xiàn)輕微卷曲。經(jīng)鹽處理24 h后，2個耐鹽品種的水稻葉片尚未出現(xiàn)明顯變化，而此時IR64的葉片明顯卷曲，且可較為清晰地看到葉尖部分的葉脈紋路顏色暗黃，表現(xiàn)出顯著的鹽脅迫特征。經(jīng)鹽處理72 h后，2個耐鹽品種的葉尖部分泛黃，幼苗生長情況依舊良好；而此時IR64的葉片卷曲得更為嚴重，且泛黃明顯。

圖2 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗的形態(tài)變化

2.4 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗SA含量的變化

由圖3可知，3個水稻品種葉片中植物激素SA的含量變化趨勢不同，但在鹽脅迫下，SA的含量都有所增加，只是不同品種中SA含量出現(xiàn)上升的時間點不同。鹽敏感品種IR64的SA含量在鹽脅迫前為（383.85±63.79） ng/g；隨著鹽脅迫時間的延長，其含量變化呈現(xiàn)出先增加后降低，再增加的規(guī)律。耐鹽品種Y兩優(yōu)900的SA含量在鹽脅迫前達到了（552.31±51.80） ng/g，高含量的SA可能與該品種的特殊耐鹽性有著一定的關系；隨著鹽脅迫時間的延長，其含量變化呈現(xiàn)出下降的趨勢，而在鹽脅迫72 h后又略微升高。另一耐鹽品種超優(yōu)千號的SA含量在鹽脅迫前為（186.49±10.76） ng/g，在鹽脅迫24 h后，SA含量增加至（427.97±26.67） ng/g，在鹽脅迫72 h時開始出現(xiàn)輕微的下降。

圖3 鹽脅迫下3個水稻品種苗期SA含量的變化

2.5 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗JA含量的變化

由圖4可知，在鹽脅迫前，鹽敏感品種IR64的JA含量明顯高于另外2個耐鹽品種；鹽脅迫24 h時，JA的含量出現(xiàn)驟降；整體來看，隨著鹽脅迫時間的延長，JA含量變化呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢。相較于鹽敏感品種IR64，2個耐鹽品種的JA含量變化較為緩和，差異不顯著。Y兩優(yōu)900品種的JA含量變化在鹽脅迫24 h內(nèi)呈現(xiàn)出下降趨勢，而在72 h其含量又有所增加；而超優(yōu)千號品種在鹽脅迫72 h內(nèi)，JA含量一直呈現(xiàn)出逐漸下降的變化規(guī)律。

圖4 鹽脅迫下3個水稻品種苗期JA含量的變化

2.6 鹽脅迫不同時間后各水稻品種幼苗ABA含量的變化

由圖5可知，ABA作為一種逆境脅迫調(diào)控激素，在正常生理條件下其含量是極低的；但在經(jīng)0.8%NaCl處理6 h后，ABA的含量顯著升高；但隨著鹽脅迫時間的延長，ABA含量均有所下降；且3個水稻品種葉片的ABA均表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，該變化規(guī)律與他人的研究結(jié)果也一致。此外，對比3個水稻品種在鹽脅迫24 h后ABA的含量可以發(fā)現(xiàn)：2個耐鹽品種的ABA含量下降恢復得較快，特別是Y兩優(yōu)900，在鹽脅迫24 h后ABA的含量已降至（99.37±4.61） ng/g；而鹽敏感品種IR64的ABA含量相比之下恢復得較為緩慢。

圖5 鹽脅迫下3個水稻品種苗期ABA含量的變化

3 討 論

研究結(jié)果表明，脫落酸（ABA）在鹽脅迫中起著非常關鍵的作用，對于脅迫環(huán)境極其敏感。鹽脅迫初期ABA迅速積累，可使氣孔關閉，降低蒸騰速率，并通過啟動植物體內(nèi)的各信號分子進行復雜的網(wǎng)絡調(diào)控，以緩解鹽脅迫造成的離子毒害和氧化損傷，尤其是滲透脅迫[18]，從而減少或避免鹽脅迫對植物生長的迫害，起到一定的保護作用。由于過多的ABA會抑制植物的生長，因此當水稻幼苗適應了這種環(huán)境脅迫后，ABA含量的降低，會讓植物恢復正常的代謝水平與生長狀態(tài)。

ABA作為植物激素響應脅迫的調(diào)控中心，同時還影響著其他植物激素的含量變化。3個水稻品種的JA含量在鹽脅迫前期均呈降低趨勢，原因尚不明確；但在鹽處理一段時間后，JA含量有所增加，原因可能是ABA的積累促進了茉莉酸信號通路阻遏蛋白JAZ（Jasmonate-ZIM-domain，JAZ）的泛素化降解[19]，從而釋放JA下游基因的表達，表現(xiàn)為茉莉酸含量的增加，使自身耐受性得到進一步的提高。與耐鹽品種不同的是，鹽敏感品種IR64本身就含有較高的茉莉酸（JA），這可能是由于不同品種之間存在理化特性差異所致。李天雪等[20]在測定不同鹽堿處理下金銀花幼苗JA含量時發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫下JA含量會有所下降，在后期才會出現(xiàn)明顯增加。試驗中JA的含量變化規(guī)律與該研究相符。

研究改進了現(xiàn)行的植物激素檢測方法，提升了植物激素檢測的靈敏度和精確度，后期需通過內(nèi)標法和衍生化處理，進一步提升植物激素前處理的回收率和檢測的穩(wěn)定性。通過探討不同耐鹽能力的水稻品種鹽脅迫0、6、24和72 h下3種植物激素的含量變化，初步分析了3種植物內(nèi)源激素含量變化規(guī)律以及激素間相互作用對水稻生長的影響，有助于解析植物激素參與水稻鹽脅迫調(diào)控的生理機制，為水稻耐鹽脅迫研究提供理論支撐。