李馭帥，劉松枝，林耀新，廖蘇玲，孫長山*

（1.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

2 型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以高血糖、胰島素分泌不足和胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）為基本病理特征的內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝性疾病[1-2]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計結(jié)果顯示[3]，2017 年 20～79 歲的成年人糖尿病患病率為 8.8%，總?cè)藬?shù)為 4.25 億，到 2045年將達到 6.29 億，2 型糖尿病患病人數(shù)約占糖尿病總?cè)藬?shù)的 95%，給患者的生活和精神造成極大的痛苦[4]。2 型糖尿病患者數(shù)量正以驚人的速度增長并已構(gòu)成人類健康的巨大威脅[5]。因此，尋求 2 型糖尿病的有效療法和有效藥物迫在眉睫。

中醫(yī)傳統(tǒng)方劑是中華民族的瑰寶，多有雙向調(diào)節(jié)作用，在治療 2 型糖尿病調(diào)節(jié)血糖等指標(biāo)的同時，可緩解和改善并發(fā)癥的發(fā)生，作用溫和持久，毒性相對較小、擁有上千年的臨床實踐經(jīng)驗、療效穩(wěn)定，可長期使用，具有西藥不可替代的綜合優(yōu)勢，近年來尋找古方治療 2 型糖尿病成為新的熱點[6]。

黃連解毒湯最早記載于東晉葛洪的《肘后備急方》中，雖無方名，但記述了方藥的組成、用法，到唐朝王燾所著《外臺秘要》才得以完善主治證候并正式命名[7]。黃連解毒湯由黃連（Coptis chinensisFranch.）9 g、黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）6 g、黃柏（Phellodendron chinenseSchneid.）6 g和梔子（Gardenia jasminoidesEllis）9 g[8]四味藥材所組成。方中黃連為君，黃芩為臣，黃柏為佐，梔子為使，苦寒諸藥合用共譜清熱解毒瀉火之效，主治實熱火毒、三焦熱盛之證，為中醫(yī)傳統(tǒng)方劑中的清熱解毒代表方[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃連解毒湯具有明確的降低血糖、血脂作用；對胰島素信號傳導(dǎo)過程中多個靶點進行影響，改善胰島素抵抗?fàn)顩r，增加胰島素敏感性；保護胰島 β 細胞[10-12]等全面且多網(wǎng)絡(luò)的治療 2 型糖尿病。

本文采用現(xiàn)代研究技術(shù)及方法，以黃連解毒湯中治療 2 型糖尿病主要成分小檗堿及梔子苷[13-14]為指標(biāo)，篩選出最佳提取工藝，制備改良適合 2 型糖尿病患者服用的無糖顆粒劑并用 SD 大鼠做藥效學(xué)研究。解決患者用藥限制和湯劑服用不便、不易貯存、穩(wěn)定性差等問題。更好地發(fā)揮黃連解毒湯治療作用。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀、C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）（美國安捷倫公司），BT25S 型電子天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），KQ5200E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），ZDHW 型電加熱套、101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），RE52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SpectraMax M3 多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司），TS-100B 恒溫搖床（捷呈實驗儀器），飛鴿KA-1000 離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

黃連、黃芩、黃柏、梔子（中國北京同仁堂集團有限公司），鹽酸小檗堿對照品、梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院），微晶纖維素（PH101，湖州展望藥業(yè)有限公司），糊精（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），可溶性淀粉、甘露醇（天津市博迪化工股份有限公司），鏈脲佐菌素（大連美侖生物技術(shù)與限公司），5D-2 型血糖儀（北京怡成生物電子技術(shù)股份有限公司），鹽酸二甲雙胍片（天津中新藥業(yè)集團股份有限公司），葡萄糖粉劑（四川康美保寧制藥有限公司），總膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），大鼠胰島素 ELISA 檢測試劑盒（江蘇寶萊生物科技有限公司），水（色譜純，杭州娃哈哈集團有限公司），其余試劑為分析純、市售。

雄性 SD 大鼠，200 ± 20 g，SPF 級，購于沈陽藥科大學(xué)動物房。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃連解毒湯提取工藝篩選及優(yōu)化

2.1.1 色譜條件及溶液的制備

色譜條件：安捷倫 C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相 A 為乙腈，流動相 B 為含體積分數(shù) 0.1% 的三乙胺、體積分數(shù)為 0.2% 的磷酸的混合水溶液，梯度洗脫：0～9 min 10%～21%A，9～15 min 21%～22%A，15～38 min 22%～23%A，38～45 min 23%～24%A，45～70 min 24%A；檢測波長 230 nm；柱溫 25 ℃；進樣量 10 μL；流速 1.0 mL·min-1，洗脫時間 70 min，后運行 10 min。

對照品溶液的制備：精密稱取梔子苷對照品、鹽酸小檗堿對照品適量，配制成梔子苷、鹽酸小檗堿濃度各自均為 60 μg·mL-1的混合溶液，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：精密稱取各提取條件下干燥提取粉 0.015 g（過 180 μm 孔徑篩）于 10 mL量瓶中，加適量甲醇溶解，超聲 10 min 至瓶底基本無粉末沉淀，放冷至室溫后定容，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.1.2 乙醇濃度單因素考察試驗

稱取 7 份三分之一處方量，每份（黃連 3 g、黃芩 2 g、黃柏 2 g、梔子 3 g）即 10 g 藥材，分別加入 10 倍即 100 mL 提取溶劑，提取溶劑分別為水和體積分數(shù)分別為 35%、45%、55%、65%、75%、90% 的乙醇，室溫下浸泡 30 min 后加熱回流提取兩次，每次提取 1 h，兩次提取藥液濾過后合并，旋蒸儀濃縮至適量體積后移至水浴鍋繼續(xù)濃縮至稠膏，烘箱 60 ℃ 干燥，稱量計算出膏率后粉碎，過 180 μm 孔徑篩，放入干燥器中保存待用。高效液相測定各提取粉中梔子苷、小檗堿（以鹽酸小檗堿計）含量并計算出各自提取率及綜合評分，以梔子苷提取率和鹽酸小檗堿提取率的綜合評分作為最終考察指標(biāo)。最終考察指標(biāo)見公式（1）、（2）、（3）：

由表1 結(jié)果可知，后續(xù)優(yōu)化的正交實驗設(shè)計可將乙醇體積分數(shù)設(shè)定為 60%、65% 和 70% 三個水平。

Table 1 Results of single factor investigation of ethanol concentration表1 乙醇濃度單因素考察結(jié)果

2.1.3 正交實驗優(yōu)化

以提取次數(shù)、提取時間、液料比、乙醇體積分數(shù)為考察因素，以梔子苷和鹽酸小檗堿提取率綜合評分為指標(biāo)設(shè)計正交實驗 L9(34)，因素水平表見表2。

Table 2 Factors and levels of orthogonal test表2 正交實驗因素和水平表

稱取 9 份三分之一處方量， 每份（黃連 3 g、黃芩 2 g、黃柏 2 g、梔子 3 g）即 10 g 藥材，按照正交表試驗安排室溫下浸泡 30 min 后進行加熱回流提取，提取藥液濾過后合并，旋蒸儀濃縮至適量體積后移至水浴鍋繼續(xù)濃縮至稠膏，烘箱 60 ℃干燥，稱量計算出膏率后粉碎，過 180 μm孔徑篩，放入干燥器中保存待用。高效液相測定各提取粉中梔子苷、小檗堿（以鹽酸小檗堿計）含量并計算出各自提取率及綜合評分，用 SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

Table 3 Visual analysis results of orthogonal experiments表3 正交實驗直觀分析結(jié)果

如表3 結(jié)果可知，對實驗結(jié)果進行直觀分析，RB＞ RC＞ RD＞ RA，即因素 B 提取次數(shù)對實驗綜合評分影響最大，而因素 A 乙醇濃度對實驗綜合評分影響最小，根據(jù)直觀分析得出最優(yōu)方案為 A1B3C3D1。

Table 4 The results of variance analysis of orthogonal experiment (Ⅰ)表4 正交實驗方差分析結(jié)果（Ⅰ）

如表4 結(jié)果可知，對實驗結(jié)果進行方差分析，誤差項的離均差平方和為 0，即 SPSS 無法計算四因素三水平正交實驗中的F值、P值。這是由于本次實驗設(shè)計中未考慮實驗誤差設(shè)置空白項而導(dǎo)致的，在沒有進行足夠重復(fù)實驗，又無空白項時可取其中離均差平方和最小的因素（本實驗中為因素 A，其離均差平方和最小為 28.078，即乙醇濃度對綜合評分影響最小）作為誤差估計[15-16]重新進行計算，結(jié)果見表5。由表5 結(jié)果可知，因素 B 即提取次數(shù)的主效應(yīng)顯著（P= 0.040 < 0.05），因素 C、D 的主效應(yīng)不顯著。

Table 5 The results of variance analysis of orthogonal experiment (Ⅱ)表5 正交實驗方差分析結(jié)果（Ⅱ）

綜合以上分析可知，軟件數(shù)據(jù)擬合的最佳組合為 A1B3C3D1，但根據(jù)直觀分析表明因素 C 不是主要影響因素，根據(jù)方差分析表明其主效應(yīng)不顯著，為節(jié)省實驗時間及成本，采用 C2而非 C3，因此最終優(yōu)化后選擇的最佳實驗組合為 A1B3C2D1，即乙醇體積分數(shù)為 60%，提取次數(shù) 3 次，每次提取時間為 2 h，藥材與提取溶劑液料比為 8 : 1，作為黃連解毒湯最優(yōu)提取方案。

2.1.4 驗證性實驗

采用得到的最優(yōu)提取方案提取 3 份黃連解毒湯三分之一處方量藥材，采用高效液相色譜法分別測定提取粉中梔子苷、小檗堿（以鹽酸小檗堿計）含量并計算出各自提取率及綜合評分，結(jié)果見表6。

Table 6 The results of verification test表6 驗證性試驗結(jié)果

結(jié)果表明，優(yōu)化得到的黃連解毒湯最佳提取方案重現(xiàn)性較好，工藝穩(wěn)定。梔子苷及鹽酸小檗堿平均提取率分別為 1.12% 和 2.53%，出膏率為 29.32%，具有良好可行性。

2.2 黃連解毒無糖顆粒劑的處方工藝研究

2.2.1 各項考察指標(biāo)及其測定方法

成型性：用顆粒的成型率來評定。取制備好的樣品顆粒精密稱重，先過中華人民共和國藥典（2015 版）一號篩，再過五號篩，左右往返，水平過篩，過篩同時輕叩篩網(wǎng)，將能通過藥典一號篩而不能通過五號篩的顆粒定為合格顆粒，對合格顆粒進行精密稱重并計算成型率，計算方法見公式（4）：

流動性：用顆粒的休止角來評定[17-18]。采用固定漏斗法，將 3 只漏斗串聯(lián)固定于距離下方水平放置的坐標(biāo)紙 1 cm 高度處，底層漏斗正對坐標(biāo)紙中心，取合格顆粒（即可通過一號篩而不能通過五號篩的顆粒），小心將其沿最上端漏斗壁倒入，直至在坐標(biāo)紙上形成顆粒圓錐體且錐體尖頂端剛好觸碰至底端漏斗口位置為止。根據(jù)坐標(biāo)紙刻度測定圓錐體的底部直徑（2R），圓錐體高度為 H，由此計算出休止角 α，平行測定三次取平均值，計算方法見公式（5）：

溶化性：用顆粒的溶化率來評定[19]。精密稱取制備好的樣品顆粒 0.5 g，放入到預(yù)先干燥至恒重的 10 mL 離心管中，精密稱重，加入 20 倍量即 10 mL 新制沸水，渦旋震蕩 5 min，將其放入離心機，3×103r.min-1離心 15 min，小心棄去上清液后，將裝有殘渣的離心管放入 80 ℃ 烘箱中烘干至恒重，精密稱定，計算溶化率。計算方法見公式（6）：

吸濕性：用顆粒的吸濕率來評定[20]。取一定量制備的樣品顆粒，置于放有五氧化二磷的保干器內(nèi)干燥至恒重。將底部盛有氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器放于 25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫 48 h，此時玻璃干燥器內(nèi)相對濕度為 75%。精密稱取 0.5 g 保干器內(nèi)保存的干燥樣品顆粒，放入已恒重的稱量瓶底部，輕輕振搖使顆粒均勻平鋪分布，精密稱重后，置于上述盛有氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器內(nèi)（稱量瓶蓋打開）于 25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱保存，分別于 2、4、6、8、10、12、24、48 和 72 h 精密稱重，計算吸濕率，計算方法見公式（7）：

采用綜合評分法對不同處方進行評分考量，總分 100 分，上述四項按順序賦予權(quán)重分值分別為 25 分、15 分、25 分和 35 分，計算各項分數(shù)后相加得到綜合評分，相關(guān)計算方法見公式（8）、（9）、（10）、（11）和（12）：

2.2.2 單一稀釋劑篩選

本文采用可溶性淀粉、糊精、微晶纖維素、甘露醇進行單一稀釋劑的篩選，采用中藥顆粒劑常用的濕法制粒方法。將藥材提取粉和不同稀釋劑過 180 μm 孔徑篩后，以 1 : 2 比例量分別混合均勻，置于研缽中，以體積分數(shù) 80% 的乙醇為潤濕劑制軟材，過 1430 μm 孔徑篩制粒，于 60 ℃ 烘箱中干燥，整粒。觀察制粒情況，顆粒性狀，并以顆粒的成型性、流動性、溶化性和吸濕性項為考察項，計算得出各處方綜合評分。

Fig.1 Moisture absorption curves in 72 h圖1 72 h內(nèi)吸濕曲線圖

如圖1 結(jié)果顯示，應(yīng)用了四種不同稀釋劑的處方顆粒均具有一定的吸濕性，四種稀釋劑 72 h內(nèi)吸濕率大小為可溶性淀粉 ＞ 糊精 ＞ 微晶纖維素 ＞ 甘露醇，由此可以看出甘露醇抗?jié)衲芰ψ顝?，且?72 h 內(nèi)已達吸濕平衡。

如表7 結(jié)果可知，應(yīng)用四種不同稀釋劑的顆粒中，綜合評分大小排序為甘露醇 ＞ 糊精 ＞ 微晶纖維素 ＞ 可溶性淀粉。

Table 7 Screening results of single diluent表7 單一稀釋劑篩選結(jié)果

由上述結(jié)果綜合分析可知，甘露醇有良好的抗?jié)裥阅芎腿芑阅?，而實驗中糊精具有良好的顆粒成型性，制軟材狀況良好，顆粒狀態(tài)良好，說明使用兩者之一任何的單一輔料不能同時滿足顆?？?jié)裥詮?、溶化性好、成型性好及流動性?yōu)的要求。因此在后續(xù)顆粒劑處方研究中，使用甘露醇和糊精兩種稀釋劑混合進行研究。

2.2.3 混合稀釋劑比例篩選

將藥材提取粉和甘露醇、糊精分別過 180 μm 孔徑篩后，分別以糊精 : 甘露醇比例為 4 : 1、3 : 1、2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4 提取粉 ：兩種稀釋劑總量比例為 1 : 2 比例量分別混合均勻，置于研缽中，以體積分數(shù) 80% 的乙醇為潤濕劑，少量多次進行滴加，并用手指不斷揉捏混勻，達到手握成團、輕壓即散的狀態(tài)時，將軟材過1 430 μm 孔徑篩制粒，于 60 ℃ 烘箱中干燥，整粒。以顆粒的成型性、流動性、溶化性和吸濕性項為考察項，計算各處方綜合評分。

如圖2 結(jié)果顯示，隨著甘露醇用量比例的增加，顆粒的吸濕性不斷減小，其中糊精 : 甘露醇為 1 : 4 時，處方抗?jié)衲芰ψ顝姡液?: 甘露醇為 1 : 3、1 : 4 時，抗?jié)衲芰ο嗖畈淮蟆?/p>

Fig.2 Moisture absorption curves in 72 h圖2 72 h 內(nèi)吸濕曲線圖

如表8 結(jié)果可知，不同混合稀釋劑比例制備的顆粒中，綜合評分大小排序為糊精 : 甘露醇為 1 : 4 = 1 : 3 ＞ 1 : 2 ＞ 1 : 1 ＞ 2 : 1 ＞ 3 : 1 ＞ 4 : 1。

Table 8 Results of proportion screening of mixed diluents表8 混合稀釋劑比例篩選結(jié)果

由上述結(jié)果綜合分析可知，糊精 : 甘露醇為 1 : 4 時抗?jié)衲芰ψ顝姡揖C合評分最高；又因糊精 : 甘露醇為 1 : 3 和 1 : 4 綜合評分相同，72 h 吸濕曲線基本無差別且甘露醇成本稍高，為節(jié)約實驗及生產(chǎn)成本采用混合稀釋劑糊精 : 甘露醇為 1 : 3 的處方進行后續(xù)顆粒劑處方研究。

2.2.4 提取粉與稀釋劑比例篩選

將藥材提取粉和甘露醇、糊精分別過 180 μm 孔徑篩后，分別以糊精 : 甘露醇比例為 1 : 3比例量，提取粉 : 稀釋劑總量比例為 3 : 1、2 : 1、1.5 : 1、1 : 1、1 : 1.5、1 : 2 混合均勻，置于研缽中，以體積分數(shù) 80% 的乙醇為潤濕劑，制軟材，過 1 430 μm 孔徑篩制粒，于 60 ℃ 烘箱中干燥，整粒。觀察制粒情況，以顆粒的成型性為考察項，計算各處方綜合評分。

由于提取粉 : 稀釋劑總量比例為 3 : 1、2 : 1、1.5 : 1 時軟材整體過黏，難以過篩制粒，因此后續(xù)只統(tǒng)計提取粉 : 稀釋劑總量比例為 1 : 1、1 : 1.5、1 : 2 的數(shù)據(jù)。

Fig.3 Moisture absorption curves in 72 h圖3 72 h 內(nèi)吸濕曲線圖

如圖3 結(jié)果顯示，隨著稀釋劑用量比例的增加，顆粒的吸濕性不斷減小，其中提取粉 : 稀釋劑比例為 1 : 2 時，處方抗?jié)衲芰ψ顝姟?/p>

如表9 結(jié)果顯示，不同提取粉與稀釋劑比例制備的顆粒中，綜合評分大小排序為提取粉 : 稀釋劑比例為 1 : 2 ＞ 1 : 1.5 ＞ 1 : 1。

Table 9 The results of the proportion selection of extraction powder and diluents表9 提取粉與稀釋劑比例篩選結(jié)果

通過采用綜合評分法綜合考察顆粒的成型性、流動性、溶化性和吸濕性，且由上述結(jié)果綜合分析可知，提取粉 : 稀釋劑比例為 1 : 2 時抗?jié)衲芰ψ顝姡揖C合評分最高，且制軟材和過篩時容易程度為提取粉 : 稀釋劑比例 1 : 2 ＞ 1 : 1.5 ＞ 1 : 1，因此采用提取粉 : 稀釋劑比例為 1 : 2 的處方進行后續(xù)顆粒劑處方研究。

2.2.5 潤濕劑篩選

通過文獻查閱發(fā)現(xiàn)，多數(shù)中藥顆粒劑采用不同體積分數(shù)乙醇以及水作為潤濕劑，而又因不同提取粉自身狀態(tài)性質(zhì)各異，因此應(yīng)對不同提取物進行針對性篩選。

將藥材提取粉和甘露醇、糊精分別過 180 μm 孔徑篩后，分別以糊精 : 甘露醇比例為 1 : 3 比例量，提取粉 : 稀釋劑總量比例為 1 : 2，混合均勻 10 份，置于研缽中，以水和體積分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 和 90% 的乙醇為潤濕劑，制軟材，過 1 430 μm孔徑篩制粒，于 60 ℃ 烘箱中干燥，整粒。觀察制粒情況。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，潤濕劑為水及小濃度乙醇時，軟材黏性較大，導(dǎo)致結(jié)塊，不易過篩制粒。但當(dāng)潤濕劑為大濃度乙醇時，軟材又過于疏松，導(dǎo)致制粒過程產(chǎn)生的細粉較多，經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn)，采用體積分數(shù)為 80% 的乙醇作為潤濕劑時制粒效果最佳，因此最終確定采用體積分數(shù)為 80%的乙醇作為潤濕劑。

2.2.6 黃連解毒無糖顆粒劑最優(yōu)處方工藝的確定

通過上述實驗確定，黃連解毒無糖顆粒劑的最優(yōu)處方為 ： 提取粉和甘露醇、糊精分別過 180 μm孔徑篩，以糊精 : 甘露醇比例為 1 : 3 比例量，提取粉 : 稀釋劑總量比例為 1 : 2 比例量混合均勻，以體積分數(shù)為 80% 的乙醇為潤濕劑，制成適宜軟材，過 1 430 μm 孔徑篩制粒，顆粒于60 ℃烘箱中干燥后整粒，分裝、密封即得。

2.2.7 最優(yōu)處方工藝驗證試驗

為保證黃連解毒無糖顆粒劑處方工藝的穩(wěn)定性，需要對試驗結(jié)果進行驗證。通過制備三批顆粒劑樣品，觀察制粒情況，顆粒性狀，并以顆粒的成型性、流動性、溶化性和吸濕性項為考察項，計算綜合評分。

Table 10 The results of process verification experiment表10 工藝驗證試驗結(jié)果

表10 結(jié)果表明，優(yōu)化得到的黃連解毒無糖顆粒劑為大小均勻的棕褐色顆粒，最優(yōu)處方工藝重現(xiàn)性較好，工藝穩(wěn)定，各指標(biāo)RSD值均小于 2%，具有良好可行性。

2.2.8 黃連解毒無糖顆粒劑工藝流程圖

根據(jù)實驗優(yōu)化得到的方劑提取和制劑處方工藝條件，工藝流程如圖4 所示。

2.3 黃連解毒無糖顆粒劑治療 2 型糖尿病的藥效學(xué)研究

2.3.1 大鼠 2 型糖尿病造模[21-22]

控制動物飼養(yǎng)實驗室內(nèi)定期進行空氣流通，溫度保持在 23 ± 2 ℃，相對濕度保持在 55 ± 5%，嚴格執(zhí)行 12 / 12 h 的晝夜光照節(jié)律，室內(nèi)保持安靜，SD 大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)大號鼠籠中，自由活動，保持飲水、飲食充足，勤換墊料。

45 只 SD 大鼠先以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，在動物飼養(yǎng)實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 d。7 d 后隨機選取出6 只大鼠作為空白對照組繼續(xù)以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng) 4 周，其他大鼠為造模組均以高脂高糖飼料（含脂肪 20%、蔗糖 15%、膽固醇 1%、膽酸鈉 0.5%）喂養(yǎng) 4 周。4 周后，所有大鼠禁食 12 h，以質(zhì)量分數(shù)為 35 mg·kg-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液給造模組大鼠腹腔快速注射，空白對照組大鼠腹腔注射同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

7 d 后觀察大鼠狀態(tài)，禁食 12 h 后，尾尖取血測定大鼠空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）以出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，且 FBG ≥ 13.8 mmol·L-1為標(biāo)準(zhǔn)，確認為 2 型糖尿病大鼠，造模成功，進入后續(xù)實驗。

45 只 SD 大鼠中，在造模期間無死亡，除去 6 只空白對照組大鼠，其余 39 只造模組大鼠中，有 35 只造模成功，成模率經(jīng)計算為 89.74%，成模率較高，模型穩(wěn)定。

2.3.2 實驗分組及給藥劑量

本次實驗分為 6 組，除空白對照組（n= 6）實驗期間飼喂普通標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余 5 組（均n=7）大鼠實驗期間均飼喂高脂高糖飼料。所有組大鼠每天定時灌胃給藥一次，連續(xù)給藥 21 d，保持正常飲食飲水供應(yīng)。分組明細及給藥劑量如下：

空白對照組（Control）：蒸餾水（與其他組等體積）。

模型組（Model）：蒸餾水（與其他組等體積）。

陽性對照組，即二甲雙胍組（Metformin）：二甲雙胍 180 mg·kg-1。

Fig.4 Process flow chart圖4 工藝流程圖

黃連解毒無糖顆粒劑低劑量組（HLJD-L）：黃連解毒無糖顆粒劑 0.78 g·kg-1，相當(dāng)于原處方生藥量 0.90 g·kg-1。

黃連解毒無糖顆粒劑中劑量組（HLJD-M）：黃連解毒無糖顆粒劑 2.34 g·kg-1，相當(dāng)于原處方生藥量 2.70 g·kg-1。

黃連解毒無糖顆粒劑高劑量組（HLJD-H）：黃連解毒無糖顆粒劑 7.02 g·kg-1，相當(dāng)于原處方生藥量 8.10 g·kg-1。

21 d 給藥結(jié)束，所有大鼠禁食 12 h 后，腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為 3.5% 的水合氯醛對大鼠進行麻醉，腹主動脈取血，于室溫下靜置 1 h 后，在 4 ℃ 下，3.5×103r·min-1離心 15 min，用移液槍小心吸取上層血清，測定相關(guān)生化指標(biāo)。

2.3.3 大鼠狀態(tài)觀察

實驗觀察發(fā)現(xiàn)，造模成功后的大鼠與空白對照組大鼠相比，疲懶聚團、嗜睡，毛發(fā)色黃枯槁，飲食量明顯增加，墊料潮濕，多尿便溏。隨著藥物治療發(fā)現(xiàn)：二甲雙胍組和黃連解毒無糖顆粒劑中、高劑量組大鼠上述情況有明顯改善，而黃連解毒無糖顆粒劑低劑量組大鼠狀態(tài)改善不明顯；實驗后期更換墊料時發(fā)現(xiàn)，墊料潮濕程度有明顯的不同，表明藥物對于尿量控制效果明顯，潮濕度排序為：Model ＞ HLJD-L ＞ HLJD-M ≈ Metformin ＞ HLJD-H ＞ Control。

2.3.4 血糖監(jiān)測

所有大鼠于給藥的第 0 d、7 d、14 d、21 d 分別禁食 12 h 后，于相同時間點尾尖取血，血糖儀測定 FBG 并記錄結(jié)果。

如圖5 結(jié)果顯示，隨著給藥療程的不斷深入，各給藥組具有持續(xù)的降血糖作用，其中以二甲雙胍組和黃連解毒無糖顆粒劑中、高劑量組效果明顯，且黃連解毒無糖顆粒劑降血糖效果具有明顯的劑量依賴性，其中高劑量黃連解毒無糖顆粒劑具有極明顯的降血糖作用，效果優(yōu)于陽性對照藥二甲雙胍。

Fig.5 Results of fasting blood glucose monitoring圖5 血糖監(jiān)測結(jié)果

2.3.5 口服葡萄糖耐量試驗（Oral glucose tolerance test，OGTT）[23]

所有大鼠于給藥第 19 d 禁食 12 h 后，以 2 g·kg-1劑量灌胃葡萄糖水溶液，分別于 0 h 及灌胃后 0.5 h、1 h、2 h 時間點尾尖取血，血糖儀測定大鼠 0 h 血糖（Blood glucose-0h，BG0h）、0.5 h 血糖（Blood glucose-0.5h，BG0.5h）、1 h血糖（Blood glucose-1h，BG1h）和2 h血糖（Blood glucose-2h，BG2h），并采用梯形累加法計算血糖曲線下面積（AUC，Area under the curve），記錄結(jié)果。計算方法見公式（13）：

如圖6、圖7 結(jié)果顯示，其他各組餐后血糖調(diào)節(jié)效果均極顯著低于 Control 組。二甲雙胍和黃連解毒無糖顆粒劑中、高劑量對于餐后血糖調(diào)節(jié)效果明顯，且黃連解毒無糖顆粒劑調(diào)節(jié)餐后血糖效果具有明顯的劑量依賴性，其中高劑量黃連解毒無糖顆粒劑具有極其明顯的餐后血糖調(diào)節(jié)作用，能極顯著減緩餐后血糖的快速上升，效果優(yōu)于陽性對照藥二甲雙胍。

Fig.6 Results of oral glucose tolerance test圖6 口服葡萄糖耐量試驗結(jié)果

2.3.6 胰島素水平測定

采用大鼠胰島素 ELISA 檢測試劑盒進行測定，按照試劑盒說明書進行操作，測定計算得出各組空腹胰島素（Fasting insulin，F(xiàn)INS）水平。

如圖8 結(jié)果顯示，二甲雙胍和黃連解毒無糖顆粒劑中、高劑量對于改善胰島素抵抗效果明顯，且黃連解毒無糖顆粒劑改善胰島素抵抗效果具有明顯的劑量依賴性：其中高劑量黃連解毒無糖顆粒劑具有極其明顯的改善胰島素抵抗作用，效果優(yōu)于陽性對照藥二甲雙胍。

2.3.7 血脂水平測定

總膽固醇（Total cholesterol，TC）采用總膽固醇測定試劑盒進行測定，按照試劑盒說明書進行操作；甘油三酯（Triglyceride，TG）采用甘油三酯測定試劑盒進行測定，按照試劑盒說明書進行操作。測定計算得出各組 TC 和 TG 水平。

Fig.7 Area under the curve of oral glucose tolerance test圖7 口服葡萄糖耐量試驗曲線下面積

Fig.8 Results of insulin level measurement圖8 胰島素水平測定結(jié)果

如圖9 結(jié)果顯示，二甲雙胍和黃連解毒無糖顆粒劑各劑量均具有降低血脂效果，說明在預(yù)防2 型糖尿病并發(fā)癥動脈粥樣硬化方面，高劑量黃連解毒無糖顆粒劑具有極其明顯作用，且黃連解毒無糖顆粒劑降低血脂的效果呈明顯劑量依賴性，以高劑量黃連解毒無糖顆粒劑調(diào)節(jié)能力最優(yōu)且最明顯，效果優(yōu)于陽性對照藥二甲雙胍。

2.3.8 肝功能指標(biāo)測定

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒進行測定，采用賴式微板比色法，按照試劑盒說明書進行操作；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）采用谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒進行測定，采用賴式微板比色法，按照試劑盒說明書進行操作。

Fig.9 Results of blood lipid level measurement圖9 血脂水平測定結(jié)果

Fig.10 Results of liver function indexes圖10 肝功能指標(biāo)測定結(jié)果

如圖10 結(jié)果顯示，二甲雙胍和黃連解毒無糖顆粒劑各劑量均具有保護肝臟，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，減輕肝損傷的作用。在預(yù)防 2 型糖尿病肝病方面，黃連解毒無糖顆粒劑中、高劑量以及二甲雙胍具有極其明顯作用，且黃連解毒無糖顆粒劑減輕肝損傷的作用效果呈明顯劑量依賴性，以高劑量黃連解毒無糖顆粒劑調(diào)節(jié)能力最優(yōu)且最明顯，效果優(yōu)于陽性對照藥二甲雙胍。

2.3.9 相關(guān)評價指標(biāo)

穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（Homeostasis model assessment for insulin resistance index，HOMAIR）[24]，是一種簡單可靠、廣泛應(yīng)用的胰島素抵抗評估方法。其計算方法見公式（14）：胰島素敏感性指數(shù)（Insulin sensitivity index，ISI）[25]，是一種簡單可靠、廣泛應(yīng)用的胰島素敏感性評估方法，因其為非正態(tài)分布，故分析時取其自然對數(shù)，計算方法見公式（15）：

如圖11 結(jié)果顯示，二甲雙胍和黃連解毒無糖顆粒劑各劑量均具有改善胰島素抵抗、增加外周對于胰島素敏感性的作用。在治療 2 型糖尿病以及改善胰島素抵抗方面，黃連解毒無糖顆粒劑中、高劑量以及二甲雙胍具有極其明顯作用，且黃連解毒無糖顆粒劑改善胰島素抵抗、增加外周對于胰島素敏感性效果呈明顯劑量依賴性，以高劑量黃連解毒無糖顆粒劑療效最優(yōu)且最明顯，效果優(yōu)于陽性對照藥二甲雙胍。

Fig.11 Evaluation results of relevant indicators圖11 相關(guān)指標(biāo)評價結(jié)果

3 討論

a.中醫(yī)傳統(tǒng)方劑成分復(fù)雜繁多，因此一般選擇其中主要明確有效的藥理成分或者根據(jù)方劑方解，聯(lián)系傳統(tǒng)中醫(yī)理論作為指標(biāo)性檢測成分[26]。黃連解毒湯中黃連和黃柏的主要成分為小檗堿，黃連為君藥且小檗堿在各種臨床和現(xiàn)代藥理研究中均有明確而有效的治療 2 型糖尿病作用，梔子苷也為梔子中主要成分，能夠有效治療 2 型糖尿病及其并發(fā)癥[13-14]；因此在本實驗中選取梔子苷和小檗堿（以鹽酸小檗堿計）作為篩選指標(biāo)。

b.梯度洗脫摸索實驗中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)脑O(shè)置后運行時間可以更好地進行流動相平衡，有效防止下一次檢測中的指標(biāo)成分峰位移動。

c.對于 SD 大鼠造模劑量及造模方法，一般有腹腔注射和尾靜脈注射兩種，劑量為 15～40 mg·kg-1不等，由于飼養(yǎng)條件、飼料配比、藥品廠家、大鼠種類及年齡等因素的影響，需提前進行預(yù)實驗找到適合自己的實驗劑量及方案。本實驗中提前進行了造模預(yù)實驗，確定最終使用高脂高糖飼料喂養(yǎng) 4 周結(jié)合腹腔注射 35 mg·kg-1鏈脲佐菌素方式造模。

d.腹腔注射鏈脲佐菌素時，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，稱量時嚴格注意避光、干燥，配好溶液后包好鋁箔紙，并保持冰浴，因其水溶液極不穩(wěn)定，且注射速度要快，需保證在 30 min 內(nèi)注射完畢更易成模。注射鏈脲佐菌素后大鼠會出現(xiàn)一個低血糖時相，因此注射后 2 d 內(nèi)造模組飲水換為 5% 葡萄糖水溶液，2 d 后恢復(fù)正常飲水防止造模組因胰島 β 細胞短時間破壞釋放大量胰島素而低血糖死亡。成模后應(yīng)每天更換兩次墊料，保持大鼠生活環(huán)境潔凈干燥，充足飲食供應(yīng)，減少死亡率。禁食時應(yīng)換墊料，防止墊料中混有飼料殘渣影響實驗結(jié)果。