江其朋，江連強，龔杰，余佳敏，楊橙，劉東陽，王金峰，陳樹鴻，李石力，杜娟，丁偉，王勇*

1 西南大學，植物保護學院，重慶 400715；2 中國煙草總公司四川省公司涼山州公司，西昌 615000；3 中國煙草總公司四川省公司，成都 610041；4 四川農(nóng)業(yè)大學，玉米研究所，成都 611130；5 四川大學，生命科學學院，成都 610064

根結線蟲病是由根結線蟲（Meloidogynespp.）侵染引起的土傳病害，嚴重危害作物根系，造成農(nóng)作物減產(chǎn)[1]。20世紀80年代以來，根結線蟲病逐步上升成為我國煙草上的主要病害之一[2]。目前，該病在我國主要煙區(qū)均有分布[3]，發(fā)病嚴重時可造成30%～50%煙葉產(chǎn)量損失，危害程度呈逐年上升的趨勢[4]，對該病的監(jiān)測預警和防治難度較大。研究表明，根結線蟲病的發(fā)生發(fā)展與土壤的類型[5]、理化性質[6-7]、微生物數(shù)量和結構等因子有著密切的關聯(lián)[8-10]。2020年，涼山州煙草根結線蟲病發(fā)生面積超過3000 hm2，會理縣發(fā)生尤為嚴重，部分感病煙田煙株死棵率超過80%，造成極大的經(jīng)濟損失和負面影響。本研究基于對四川省涼山州會理縣煙草根結線蟲病土壤數(shù)據(jù)的采集和分析，系統(tǒng)解析了土壤理化性質、微生物因子與煙草根結線蟲病發(fā)生的相關性，旨在為涼山煙區(qū)根結線蟲病的監(jiān)測預警和防控技術研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草根結線蟲病發(fā)病和未發(fā)病土壤以及發(fā)病煙株根系采自四川省涼山州會理縣黎溪鎮(zhèn)新堰村。采樣點為4塊相鄰但獨立的發(fā)病和未發(fā)病煙田（共8塊）。發(fā)病煙田前茬作物為玉米，未發(fā)病煙田前茬作物為小麥。種植的煙草品種均為中川208，采用統(tǒng)一漂浮育苗和田間管理，移栽時間為2020年5月2日，移栽后20 d田間煙株根系出現(xiàn)明顯根結且煙株有一定矮化（5月22日），移栽后90 d，煙草線蟲病害發(fā)生到達發(fā)病高峰期，煙葉采收后期（9月上旬），煙田根結線蟲病發(fā)生趨于穩(wěn)定，按GB/23222—2008《煙草病蟲害分級及調查方法》國家標準調查根結線蟲病發(fā)生情況，發(fā)病煙田根結線蟲病發(fā)病率為95.00%，病情指數(shù)為94.78，未發(fā)病地塊煙株無明顯根結線蟲病癥狀。

發(fā)病和未發(fā)病土壤樣品采集時間為3月14日，為煙苗移栽和施肥前。采用5點取樣法，每塊煙田采集的5份樣品混勻為1個重復，每個重復500 g，發(fā)病和未發(fā)病各4份土壤樣品。發(fā)病煙株根系樣品采集時間為6月30日，每塊發(fā)病煙田采集3株發(fā)病煙株根系樣品，共12份根系樣品。樣品詳細信息如表1所示。

表1 土壤及感病煙草根系樣品采集地理信息Tab. 1 Information of soil samples and root of infected tobacco

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤二齡線蟲計數(shù)

分別稱取挑除雜質的發(fā)病和未發(fā)病煙田土壤100 g，采用貝曼漏斗法對土壤中的線蟲進行分離，并對二齡線蟲（J2）進行計數(shù)。測定土壤含水量，計算100 g干土中二齡線蟲數(shù)。

1.2.2 煙草根結線蟲的形態(tài)學鑒定

采用直接解剖法，從病株根結中分離根結線蟲雌蟲和雄蟲。將分離得到的根結線蟲雌蟲置45%乳酸溶液中，制備會陰花紋和雌蟲蟲體前部樣本。將分離得到的根結線蟲雄蟲采用溫熱法殺死，用2.5%福爾馬林固定液固定。將雌蟲的會陰花紋、蟲體前部、雄蟲等挑到載玻片上制成臨時玻片，在光學顯微鏡下進行形態(tài)學觀察、拍照和測量，記錄線蟲群體口針長度（ST）、背食道腺開口到口針基部球的距離（DGO）、排泄孔到頭端的距離（EP-HE）和口針基球圓寬高比（STKW/STKH），并對照已報道根結線蟲的種類特征進行形態(tài)學種類鑒定。

1.2.3 煙草根結線蟲的分子鑒定

采用淺盤法對根結線蟲病發(fā)生煙株根系中的線蟲進行分離[11]，采用離心法收集線蟲，按照林伯榮等的方法提取樣品線蟲DNA[12]。采用PCR特異擴增方法對根結線蟲種類進行分子鑒定，8種常見的根結線蟲序列特異性擴增區(qū)標記的特異引物如表2所示，以南方根結線蟲DNA為陽性對照。

表2 8種常見根結線蟲鑒定特異性引物Tab. 2 Specific primers for identification of 8 kinds of common root-knot nematodes

25 μL PCR擴增體系：10×PCR Buffer 2.5 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、20 mmol/L MgCl21.5 μL、10 μmol/L引物各1 μL、DNA模板2 μL，ddH2O補足至25 μL。

PCR擴增條件：95℃預變性5 min；94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min，擴增產(chǎn)物于4℃保存。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠成像系統(tǒng)觀測拍照。

1.2.4 土壤理化性質分析

土壤理化性質測定參照《土壤農(nóng)化分析》[13]。土壤有效磷含量測定采用Olsen法，速效鉀采用醋酸銨浸提-火焰光度法，交換性鈣、交換性鎂采用醋酸銨法，有效銅采用DTPA/HCl浸提-原子吸收光譜法。

pH采用電極法（水土比1:2.5）進行測定。稱取10 g室溫自然風干后過10目（2 mm）尼龍網(wǎng)篩的土壤樣品于50 mL小燒杯中，加入25 mL超純水，攪拌5 min，靜置30 min，取上清液用pH計測定土壤溶液pH。

1.2.5 土壤微生物群落結構分析

采用土壤微生物DNA快速提取試劑盒（FastDNA Spin Kit，MP Biomedicals，美國）對土壤樣品微生物總DNA進行提取。

將提取的土壤微生物總DNA進行PCR擴增建立測序文庫。對細菌16S rRNA特異性V3～V4可變區(qū)進行擴增，上游引物為515F（5’-GTGCCAGCMG CCGCGG-3’），下 游 引 物 為806R（5’-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3’）。對真菌ITS特異性可變區(qū)進行擴增，上游引物為ITS1F （5’-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3’），下游引物為ITS2R（5’-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3’）。

擴增結束后，采用Illumina MiSeq PE300平臺進行測序分析，通過對原始測序數(shù)據(jù)獲得樣本中真實的序列信息ASVs（Amplicon Sequence Variant），基于ASVs代表序列信息和豐度信息，進行后續(xù)的物種分類學分析、群落多樣性分析、物種組成分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖表制作

利用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理；使用SPSS 17.0軟件計算每組數(shù)據(jù)的平均值和標準誤，并檢驗組間差異顯著性；使用Origin 2019b進行繪圖。

2 結果

2.1 會理縣黎溪鎮(zhèn)煙草根結線蟲種類鑒定

對會理縣黎溪鎮(zhèn)分離的煙草根結線蟲進行形態(tài)學觀察和拍照，結果如圖1所示，線蟲ST值、DGO值和EP-HE值等測量參數(shù)如表3所示。雌蟲會陰花紋背弓高、近方形、線紋平滑到波浪形，側線不明顯，側區(qū)線紋有明顯間斷和分岔（圖1b）。雌蟲的會陰花紋、口針形態(tài)、ST值、DGO值、EP-HE值基本符合南方根結線蟲的特征，初步鑒定為南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）。

圖1 煙草根結線蟲雌蟲前體(a)、雌蟲會陰花紋(b)和雄蟲前體(c)形態(tài)Fig. 1 Morphology characteristics of female (a), perineal pattern(b) and male(c) of tobacco root-knot nematode

表3 煙草根結線蟲雌蟲群體測量參數(shù)Tab. 3 Parameter of female tobacco root-knot nematodes

進一步對黎溪鎮(zhèn)采集的煙草根結線蟲進行分子鑒定，結果如圖2所示。經(jīng)南方根結線蟲特異性引物MiSF/MiSD擴增后，南方根結線蟲DNA和檢測樣品DNA均擴增出約500 bp的條帶，其他7種根結線蟲特異性引物均未獲得有效擴增條帶，說明會理縣黎溪鎮(zhèn)煙草根結線蟲種類為南方根結線蟲。

圖2 煙草根結線蟲PCR擴增鑒定結果Fig. 2 PCR amplification results of specific primers of different tobacco nematodes

2.2 影響煙草根結線蟲病的土壤理化因子分析

會理縣黎溪鎮(zhèn)煙草根結線蟲病發(fā)病和未發(fā)病土壤二齡線蟲數(shù)和理化性質檢測結果表明（表4），煙草根結線蟲病發(fā)病和未發(fā)病煙田土壤中均檢測出二齡根結線蟲，發(fā)病煙田100 g干土中二齡線蟲數(shù)均值達312個，未發(fā)病煙田僅為106個。

表4 煙草線蟲病發(fā)病與未發(fā)病土壤二齡線蟲數(shù)和理化性質Tab. 4 Number of second-stage juvenile (J2) and soil physical and chemical properties of diseased soil and Non-disease soil

發(fā)病土壤理化性質數(shù)值與未發(fā)病土壤呈現(xiàn)出明顯的差異。其中，發(fā)病土壤pH較未發(fā)病土壤低0.88（P<0.001）。同時，發(fā)病土壤的交換性鈣、交換性鎂、有效銅和有效硼含量分別較未發(fā)病土壤低71.76%（P<0.001）、80.90%（P<0.001）、52.25%（P<0.01）和52.50%（P>0.05）。

2.3 影響煙草根結線蟲病的細菌群落分析

根結線蟲病發(fā)病和未發(fā)病的土壤的細菌群落結構α多樣性分析結果如表5所示。線蟲發(fā)病土壤的細菌ASVs（Amplicon Sequence Variant）總數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)均低于未發(fā)病土壤，表明發(fā)病土壤細菌群落的豐富度和多樣性均低于未發(fā)病土壤，但僅Shannon多樣性指數(shù)的組間差異性達到顯著性水平（P<0.05）。

表5 煙草根結線蟲病發(fā)病與未發(fā)病土壤細菌的Alpha多樣性Tab. 5 Bacterial alpha diversity of tobacco root-knot nematodes diseased soil and Non-disease soil

線蟲發(fā)病與未發(fā)病土壤細菌群落結構β多樣性分析結果如圖3所示。發(fā)病土壤共檢測出3668個細菌ASVs，歸類到28個細菌門，未發(fā)病土壤共檢測出4735個細菌ASVs，歸類到35個門，其中27個門（864個ASVs）為發(fā)病和未發(fā)病土壤所共有（圖3a）。發(fā)病土壤的綠彎菌門（Chloroflexi）豐度顯著高于未發(fā)病土壤，而發(fā)病土壤中的芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Myxococcota、Nitrospirota和Methylomirabilota均 顯著低于未發(fā)病土壤（圖3b）。在屬水平上，發(fā)病土壤中的類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Gaiella、Haliangium均顯著低于未發(fā)病土壤（圖3c）。

土壤理化性質和細菌群落結構的冗余分析結果表明，土壤交換性鈣（R2=0.9133，P=0.015）、交換性鎂（R2=0.9441，P=0.017）和有效銅（R2=0.7926，P=0.025）含量以及pH值（R2=0.9441，P=0.017）對整體土壤細菌群落的結構產(chǎn)生顯著影響，同時，這4種關鍵的土壤理化性質對芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）有較高的正相關性（圖3d）。

圖3 煙草根結線蟲病發(fā)病和未發(fā)病土壤細菌群落組成及其影響因子Fig. 3 Bacterial community composition of tobacco root-knot nematodes diseased soil and Non-disease soil and the influence factors

2.4 影響煙草根結線蟲病的真菌群落分析

根結線蟲病發(fā)病和未發(fā)病的土壤的真菌群落結構α多樣性分析結果如表6所示。線蟲發(fā)病土壤的真菌ASVs總數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)均低于未發(fā)病土壤，表明發(fā)病土壤真菌群落的豐富度和多樣性均低于未發(fā)病土壤，但僅Chao1指數(shù)的組間差異性達到顯著性水平（P<0.05）。

表6 煙草根結線蟲病發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌的Alpha多樣性Tab. 6 Fungal alpha diversity of tobacco root-knot nematodes diseased soil and Non-disease soil

根結線蟲病發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌群落結構β多樣性分析結果如圖4所示。發(fā)病土壤共檢測出653個真菌ASVs，歸類到10個真菌門，未發(fā)病土壤共檢測出987個真菌ASVs，歸類到12個門，其中9個門（260個ASVs）為發(fā)病和未發(fā)病土壤所共有（圖4a）。發(fā)病土壤與未發(fā)病土壤中，子囊菌門（Ascomycota）均為豐度最高的真菌門，豐度超過80%。發(fā)病土壤的Basidiomycota門、鐮刀菌屬（Fusarium）和赤霉菌屬（Gibbererlla）豐度均顯著低于未發(fā)病土壤（圖4b、圖4c）。

土壤理化性質和真菌群落結構的冗余分析結果表明，土壤交換性鎂（R2=0.9327，P=0.012）和交換性鈣（R2=0.8920，P=0.016）含量以及pH值（R2=0.7914，P=0.027）對整體土壤真菌群落的結構產(chǎn)生顯著的影響，同時，這3種關鍵的土壤理化性質與赤霉菌屬（Gibbererlla）、鐮刀菌屬（Fusarium）、Ramophialophora和新赤殼屬（Neocosmospora）具有較高的正相關性（圖4d）。

圖4 煙草根結線蟲病發(fā)病和未發(fā)病土壤真菌群落組成及其影響因子Fig. 4 Fungal community composition of tobacco root-knot nematodes diseased soil and Non-disease soil and the influence factors

2.5 根結線蟲與土壤理化性質和微生物群落的互作關系分析

土壤中二齡線蟲數(shù)與土壤理化性質和細菌、真菌主要類群的相關性分析結果如圖5所示。結果表明，交換性鎂（R=-0.945，P<0.01）、交換性鈣（R=-0.952，P<0.01）、有效銅（R=-0.977，P<0.01）含量和pH值（R=-0.865，P<0.01）與土壤中二齡線蟲數(shù)呈顯著負相關（P<0.01），相關性均高于0.86，有機質含量與二齡線蟲數(shù)顯著正相關（R=0.856，P<0.01，圖5a）。細菌群落Chao1指數(shù)（R=0.656，P>0.05）、Shannon指數(shù)（R=0.688，P>0.05）和ASV數(shù)（R=0.077，P>0.05）與二齡線蟲數(shù)正相關，但均未達到顯著性水平。真菌群落Chao1指數(shù)與二齡線蟲數(shù)顯著負相關（R=-0.792，P<0.05），Shannon指 數(shù)（R=-0.632，P>0.05）和ASV數(shù)（R=-0.162，P>0.05）也與二齡線蟲數(shù)呈負相關，但未達到顯著性水平。

細菌群落芽單胞菌門（Gemmatimonadota，R= -0.865，P<0.01）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides，R=-0.729，P<0.05）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas，R=-0.766，P<0.05）、Gaiella（R=-0.902，P<0.01）和Haliangium（R=-0.870，P<0.01）的相對豐度與二齡線蟲數(shù)呈顯著負相關，而綠彎菌門（Chloroflexi，R=0.882，P<0.01）、Bryobacter（R=0.921，P<0.01）、Conexibacter（R=0.879，P<0.01）和 慢生 根 瘤 菌 屬（Bradyrhizobium，R=0.912，P<0.01）與二齡線蟲數(shù)呈顯著正相關。真菌群落擔子菌門（Basidiomycota，R=-0.792，P<0.05）、鐮 刀 菌 屬（Fusarium，R=-0.768，P<0.05）、Saitozyma（R=-0.723，P<0.05）和 赤 霉 菌 屬（Gibberella，R=-0.851，P<0.05）與土壤中二齡線蟲數(shù)呈顯著負相關。

3 討論

3.1 土壤微生物群落與煙草根結線蟲病發(fā)生的關系

豐富度高、多樣性強且處于動態(tài)平衡的土壤微生物區(qū)系能有效抑制土壤中病原微生物的數(shù)量和活性，減輕土傳病害的發(fā)生[14-15]，而土傳病害的發(fā)生往往與土壤微生物群落結構失衡有著密切關聯(lián)[16-17]。研究表明，土壤改良能顯著提高土壤微生物多樣性，促進食細菌和食真菌類線蟲的種類和數(shù)量，從而抑制植食性線蟲的繁殖，實現(xiàn)對根結線蟲病的有效控制[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草根結線蟲病未發(fā)生土壤的細菌和真菌豐富度和多樣性均高于發(fā)病土壤，這與祝明亮[8]和冀宇等[20]的研究結果相符。一些土壤微生物類群在整個抑病微生物群落中具有突出的地位，對根結線蟲的生長和繁殖具有顯著的抑制作用[21-22]。黃闊等對影響四川涼山地區(qū)煙草根結線蟲病發(fā)生的微生物因子分析結果表明，假單胞菌屬（Pseudomonas）與煙草根結線蟲病發(fā)生呈負相關，Bryobacter、錐毛殼屬（Coniochaeta）與煙草根結線蟲病發(fā)生呈正相關[1,20]。本研究發(fā)現(xiàn)的可能具有抑制根結線蟲病發(fā)生功能的關鍵微生物類群在根結線蟲病未發(fā)病土壤中的相對豐度均高于發(fā)病土壤，且其相對豐度與土壤二齡線蟲數(shù)呈顯著負相關，其中，細菌類群芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）和真菌類群鐮刀菌屬（Fusarium）和赤霉菌屬（Gibbererlla）等均未見報道，但芽單胞菌屬（Gemmatimonas）[23]和赤霉菌屬（Gibbererlla）[24]等曾多次被報道在煙草青枯病未發(fā)病的土壤中豐度更高，被認為可能與維護土壤健康有關[25]。因此，相關結論有待進一步研究確認。

3.2 土壤理化性質與煙草根結線蟲病以及土壤微生物群落的關系

土壤pH[26]、交換性鈣等土壤理化性質能塑造土壤微生物的群落結構[27]，對植物病害產(chǎn)生重要影響[28]。本研究和施河麗等[7]的研究均發(fā)現(xiàn)，煙草根結線蟲病發(fā)病和未發(fā)病的土壤理化因子存在明顯的差異，未發(fā)病土壤交換性鈣和有效銅含量均顯著高于發(fā)病土壤。呂和平等[29]的研究表明，土壤中添加含銅鹽類物質對土壤中根結線蟲卵囊、卵孵化及其幼蟲存活均有不同程度的影響，這從側面說明有效銅與根結線蟲病的發(fā)生可能存在密切的關聯(lián)。同時，本研究還進一步揭示了土壤交換性鈣、交換性鎂、有效銅和pH值與土壤中二齡線蟲數(shù)呈顯著負相關，且土壤理化因子顯著影響土壤細菌和真菌的微生物群落組成和多樣性，但對于土壤理化性質與二齡線蟲以及土壤微生物的相互作用機制還有待進一步研究。

本研究探究的影響煙草根結線蟲病發(fā)生的關鍵因子僅基于對會理縣黎溪鎮(zhèn)相關數(shù)據(jù)的分析，具有一定的局限性，后續(xù)需進一步開展相關驗證研究，明確關鍵因子與病原根結線蟲和根結線蟲病發(fā)生的關系。

4 結論

本研究通過分析涼山州會理縣發(fā)病土壤和未發(fā)病土壤的二齡線蟲數(shù)、土壤理化性質和微生物群落組成，找到了影響煙草根結線蟲病發(fā)生的關鍵因子。結果表明：（1）土壤交換性鈣、交換性鎂、有效銅和pH值含量偏低有利于煙草根結線蟲病的發(fā)生；（2）土壤中細菌芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、真菌鐮刀菌屬（Fusarium）和赤霉菌屬（Gibbererlla）等微生物類群可能對煙草根結線蟲和根結線蟲病具有一定抑制作用。本研究為涼山煙區(qū)根結線蟲病的監(jiān)測預警和及時有效防控提供理論依據(jù)，后續(xù)可對這些關鍵因子開展進一步的驗證研究，以明確其影響根結線蟲病發(fā)生的內在機制。