劉均，李強(qiáng)，譚蓉*

（1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016；2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310016）

斑馬魚（Zebrafish）是一種新型模式生物，具有體型小，易于飼養(yǎng)，性成熟期短，繁殖能力強(qiáng)，體外受精和發(fā)育，胚胎發(fā)育快，胚體透明等特點(diǎn)，便于實(shí)時(shí)觀察組織器官發(fā)生形成的各個(gè)環(huán)節(jié)，已成為生命科學(xué)研究的新寵，被廣泛用于構(gòu)建人類的各種疾病模型，建立藥物篩選和治療的研究平臺(tái)。截止目前，利用斑馬魚可以構(gòu)建糖尿病[1-2]、高血脂[3-4]、高尿酸癥[5-6]、失眠[7-8]等生物模型開展靶向藥物篩選及功能評(píng)價(jià)研究。以斑馬魚為對(duì)象建立糖尿病模型，目前主要是以成魚為對(duì)象，方法如下：采用四氧嘧啶（alloxan，ALX）或鏈脲佐菌素藥物[1，9]腹腔注射；采用ALX與高糖溶液聯(lián)合誘導(dǎo)[2]造成胰島細(xì)胞損傷型糖尿病模型；過(guò)度飼喂法[10]誘發(fā)胰島素抵抗型2型糖尿病模型。而采用斑馬魚幼魚建模的研究還比較鮮見(jiàn)。斑馬魚具有養(yǎng)殖方便、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎體外受精等顯著優(yōu)勢(shì)，尤其是利用剛孵化的幼魚開展實(shí)驗(yàn)研究，可以有效縮短試驗(yàn)周期，并且利用微孔板操作可以有效節(jié)約實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。因此，研究以斑馬魚幼魚（5 days post fertilization，5 dpf）為對(duì)象，系統(tǒng)研究了不同濃度葡萄糖（glucose，GLU）溶液、ALX藥物及其組合對(duì)斑馬魚GLU水平的影響并探討建立了糖代謝異常斑馬魚生物模型。

桑葉（moras folium，MF）是我國(guó)傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)作物，是蠶的主要食物，中醫(yī)稱其具有疏散風(fēng)熱，清肺潤(rùn)燥，清肝明目的功效。絞股藍(lán)（gynostemma pentaphyllum，GP）有“南方人參”之稱，具有降血脂，調(diào)血壓防治血栓，調(diào)節(jié)血糖等功效。目前，市場(chǎng)上已有較多的MF和GP單品或復(fù)合代用茶銷售，但其實(shí)際功效大都缺乏試驗(yàn)論證。因此，研究首先以MF和GP葉全水浸提物為對(duì)象，在研究斑馬魚對(duì)MF和GP藥物耐受性影響的基礎(chǔ)上，指導(dǎo)開展基于已開發(fā)構(gòu)建的糖代謝異常斑馬魚生物模型的MF和GP的降糖效應(yīng)評(píng)估，為健康功能食品開發(fā)提供基礎(chǔ)理論和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)也為高通量斑馬魚降糖藥物篩選及復(fù)方產(chǎn)品開發(fā)提供多方案參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器及試劑

（1）儀器。酶標(biāo)儀（Multiskan SkyHigh，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；全自動(dòng)智能型生化（霉菌）培養(yǎng)箱（天津市宏諾儀器有限公司）；精密電子天平（AL-204，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；手持式高速勻漿機(jī)（MY-20，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；離心機(jī)（3K1S，德國(guó)sigma離心機(jī)公司）；水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

（2）試劑。GLU（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；GLU檢測(cè)（葡萄糖氧化酶法）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；三卡因甲磺酸（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易公司）；ALX（CAS號(hào)：2244-11-3，純度≥98.0%；合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）：1 mM ALX母液制備，稱量0.0144 g ALX于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙獠⒍ㄈ萦?00 mL容量瓶中，冷藏備用。準(zhǔn)確量取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL上述1 mM ALX母液，加蒸餾水定容至50 mL分別制成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mM的ALX溶液。

阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）：50 mg/mL ACA（以生藥量計(jì)）貯備液制備，稱取5 g ACA于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙膺^(guò)濾后定容至100 mL制得50 mg/mL ACA（以生藥量計(jì)）儲(chǔ)備液，保存于4℃冷藏備用。準(zhǔn)確量取0.40 mL上述ACA儲(chǔ)備液，加蒸餾水定容至50mL制成400μg/mL的ACA溶液。

（3）儲(chǔ)備液制備。MF鮮葉采摘自安徽，按綠茶加工工藝自制。50 mg/mL MF（以生藥量計(jì)）儲(chǔ)備液制備：稱取5 g MF于燒杯中，在80℃恒溫水浴鍋中浸提3次，每次浸提30 min，合并濾液并定容至100 mL制得50 mg/mL MF（以生藥量計(jì)）儲(chǔ)備液，保存于4℃冷藏備用。準(zhǔn)確量取0、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、4.00、8.00和10.00 mL上述MF儲(chǔ)備液，加蒸餾水定容至50 mL分 別 制 成0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000μg/mL的MF溶液。GP（平利縣興強(qiáng)富硒茶業(yè)專業(yè)合作社）：50 mg/mL GP（以生藥量計(jì)）儲(chǔ)備液制備方法如50 mg/mL MF（以生藥量計(jì)）儲(chǔ)備液制備相同。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚（3月齡，AB型，上海費(fèi)曦生物科技有限公司）。斑馬魚胚胎的繁殖以自然交配方式進(jìn)行。每個(gè)產(chǎn)卵盒中按1∶1放入公魚和母魚，放入28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中。光周期設(shè)置：14 h光照與10 h黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和糞便，清洗后換孵育水（60μg/mL海鹽水），置于28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫孵育，每24 h換水一次，并去掉卵膜和死卵。實(shí)驗(yàn)完成后，采用三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行麻醉處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度GLU孵育對(duì)斑馬魚GLU水平的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予0、10、14、18、22、26 mg/mL GLU溶液，每個(gè)重復(fù)加藥物5 mL，培養(yǎng)24 h，每個(gè)重復(fù)取10條魚，加入100μL磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測(cè)定GLU含量，探究GLU建立糖代謝異常斑馬魚模型的可行性。

1.2.2 不同濃度ALX孵育對(duì)斑馬魚GLU水平的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予0、0.02、0.04、0.06、0.08 mM ALX溶液，每個(gè)重復(fù)加藥物5 mL，培養(yǎng)24 h，每個(gè)重復(fù)取10條魚，加入100μL磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.02）勻漿后用于測(cè)定GLU含量，探究ALX建立糖代謝異常斑馬魚模型的可行性。

1.2.3 GLU與不同濃度ALX聯(lián)合孵育對(duì)斑馬魚GLU值的影響

基于不同濃度GLU和ALX對(duì)斑馬魚GLU值的影響結(jié)果優(yōu)選藥物組合開展糖尿病斑馬魚建模方案研究。將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為5組，分別記為BC1、BC2、MC1、MC2、MC3，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予0mg/mL GLU+0 mM ALX、22 mg/mL GLU+0 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.04 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.08 mM ALX溶液，每個(gè)重復(fù)加藥物5 mL，培養(yǎng)24 h，每個(gè)重復(fù)取10條魚，加入100μL磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測(cè)定GLU含量，探究GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型的可行性。

1.2.4 不同濃度MF孵育對(duì)斑馬魚死亡率的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予 0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000μg/mL MF溶液（以生藥量計(jì)），每個(gè)重復(fù)加藥物5 mL，置于28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h換水一次，記錄每個(gè)重復(fù)斑馬魚幼魚死亡數(shù)量，并計(jì)算每組死亡率，優(yōu)選劑量作為降糖作用評(píng)價(jià)用劑量濃度。

1.2.5 不同濃度GP孵育對(duì)斑馬魚死亡率的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予 0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000μg/mL GP溶液（以生藥量計(jì)），每個(gè)重復(fù)加藥物5 mL，置于28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h換水一次，記錄每個(gè)重復(fù)斑馬魚幼魚死亡數(shù)量，并計(jì)算每組死亡率，優(yōu)選劑量作為降糖作用評(píng)價(jià)用劑量濃度。

1.2.6 不同濃度MF和GP對(duì)高糖誘導(dǎo)糖代謝異常斑馬魚GLU值的影響

根據(jù)斑馬魚對(duì)MF和GP的耐受性分析結(jié)果開展降糖作用評(píng)價(jià)。將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分為8組，分別記為BC1、BC2、MFT1、MF-T2、MF-T3、GP-T1、GP-T2、GP-T3，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予0 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU+200μg/mL MF、22 mg/mL GLU+400μg/mL MF、22 mg/mL GLU+800 μg/mL MF、22 mg/mL GLU+200μg/mL GP、22 mg/mL GLU+400μg/mL GP、22 mg/mL GLU+800μg/mL GP溶液，每個(gè)重復(fù)加藥物5 mL，培養(yǎng)至24 h，每個(gè)重復(fù)取10條魚，加入100μL磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測(cè)定GLU含量，探究在能量攝入過(guò)多的情況下MF和GP的降糖效應(yīng)。

1.2.7 不同濃度MF和GP對(duì)糖尿病斑馬魚GLU值的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚給予22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX聯(lián)合孵育24 h以誘導(dǎo)糖尿病模型，然后將已建立的糖尿病斑馬魚隨機(jī)分為8組，分別記為MC1、MF-T1、MF-T2、MFT3、GP-T1、GP-T2、GP-T3、ACA-T，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予22 mg/mL GLU、22mg/mL GLU+200μg/mL MF、22 mg/mL GLU+400 μg/mL MF、22 mg/mL GLU+800μg/mL MF、22 mg/mL GLU+200μg/mL GP、22 mg/mL GLU+400μg/mL GP、22 mg/mL GLU+800μg/mL GP、22 mg/mL GLU+400μg/mL ACA聯(lián)合孵育24 h。同步設(shè)置0 mg/mL GLU孵育48 h（期間孵育24 h時(shí)換水一次）作為BC1空白對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)取10條魚，加入200μL磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測(cè)定GLU含量，探究ML和GP處理對(duì)糖尿病糖斑馬魚模型降糖作用的影響。

1.3 檢測(cè)方法

GLU含量檢測(cè)按如下步驟進(jìn)行，取適量磷酸緩沖鹽溶液于裝魚的1.5 mL離心管中，采用高速手持式勻漿機(jī)勻漿1 min，直至魚體組織裂解充分，然后于4℃下以2500轉(zhuǎn)/秒離心10 min，結(jié)束后取上清樣2.5μL采用GLU檢測(cè)試劑盒（GLU氧化酶法）測(cè)定GLU濃度，其測(cè)定程序和方法按照試劑盒說(shuō)明書規(guī)定的步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步處理后，用Graphpad Prism 6.0繪圖，并用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)，差異顯著性采用Duncan分析并將進(jìn)行多重比較，p＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度GLU孵育對(duì)斑馬魚GLU值的影響

不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)對(duì)斑馬魚葡萄糖值的影響如圖1所示。從圖1中可以看出，隨著孵育水GLU濃度的增加，斑馬魚GLU值也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且當(dāng)GLU濃度在22 mg/mL及以上時(shí)斑馬魚GLU值出現(xiàn)顯著性變化（p＜0.05）。相比空白組，22、26和30 mg/mL GLU處理組斑馬魚GLU值分別增加了54.86%、55.48%和65.61%，均達(dá)到差異顯著水平（p＜0.05）。

前述認(rèn)可最初興起于概括代理人，后擴(kuò)至其他類型的代理人，從而使之不至于(至少在最開始的時(shí)候)與受委任人完全等同起來(lái)，后者不具有這一點(diǎn)。即便在兩項(xiàng)制度融合之后，依然如故。

圖1 不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)對(duì)斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.1 Effect of different concentrations of glucose on the level of glucose of zebrafish

2.2 不同濃度ALX孵育對(duì)斑馬魚GLU值的影響

不同濃度ALX孵育對(duì)斑馬魚GLU值的影響見(jiàn)圖2。隨著孵育水中ALX濃度的增加，斑馬魚GLU值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，0.04、0.06、0.08和0.10 mM ALX處理組斑馬魚GLU值分別增加了75.03%、69.52%、115.38%和65.61%，差異均顯著 （p＜0.05）。

圖2 不同濃度ALX誘導(dǎo)對(duì)斑馬魚葡萄糖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of alloxan on the level of glucose of zebrafish

2.3 GLU與不同濃度ALX聯(lián)合孵育對(duì)斑馬魚GLU值的影響

基于不同濃度GLU與ALX對(duì)斑馬魚GLU值的調(diào)節(jié)作用，GLU與不同濃度ALX聯(lián)合孵育對(duì)斑馬魚GLU值的影響見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，相比BC1組，BC2組斑馬魚GLU值增加了119.48%，達(dá)到差異顯著水平（p＜0.05），與前期結(jié)果較為一致。另外，MC1、MC2和MC3組斑馬魚GLU值分別增加了391.99%、491.16%和432.04%，均差異顯著（p＜0.05）。因而綜合成本等因素，選用22 mg/mL GLU與0.02 mM ALX聯(lián)合用于糖尿病病理模型建模、驗(yàn)證及靶向降糖作用評(píng)價(jià)研究。

圖3 葡萄糖與四氧嘧啶聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.3 Effect of glucose and alloxan on the level of glucose of zebrafish

2.4 斑馬魚對(duì)MF和GP耐受性的影響

不同濃度MF和GP及其孵育時(shí)間對(duì)斑馬魚死亡率的影響見(jiàn)表1和表2。從表1中可以看出，斑馬魚對(duì)高濃度MF溶液具有長(zhǎng)時(shí)不耐受性，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)死亡率不斷增加。MF濃度≥8000μg/mL孵育48 h死亡率達(dá)到63.89%，但孵育24 h內(nèi)對(duì)致死率影響較小。若需采用ML孵育48 h，采用SPSS中PROBIT程序分析得出斑馬魚幼魚的MF耐受性（表3），死亡率與MF濃度間的關(guān)系為：Probit（p）=-1.923+0.000337X，按該模型計(jì)算得出MF的LC50為5706.06μg/mL，95%可信范圍為4732.39～7067.28μg/mL。

表1 不同濃度的桑葉水提物對(duì)斑馬魚耐受性的影響Table 1 Effect of different concentrations of the aqueous extract of moras folium（MF）on the lethality rate of zebrafish

表3 斑馬魚幼魚桑葉水提物耐受性影響的參數(shù)估計(jì)表Table 3 Parameter estimates of the tolerance of zebrafish larvae in the aqueous extract of moras folium

此外，斑馬魚對(duì)高濃度GP溶液也具有不耐受性（表2），并且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)死亡率增加，但相比MF來(lái)說(shuō)，其致死作用明顯弱于MF。GP在最高濃度10000μg/mL孵育48 h的最高致死率僅為26.67%，孵育72 h時(shí)致死率為57.78%。若需采用GP孵育72 h，采用SPSS中PROBIT程序分析得出斑馬魚幼魚的GP耐受性（表4），死亡率與GP濃度間的關(guān)系為：Probit（p）=-1.711+0.000175X，按該模型計(jì)算得出GP的LC50為9766.18 μg/mL，95%可 信 范 圍 為 7669.52～13927.51μg/mL。

表2 不同濃度的絞股藍(lán)葉水提物對(duì)斑馬魚耐受性的影響Table 2 Effect of different concentrations of the aqueous extract of gynostemma pentaphyllum（GP）leaves on the lethallty rate of zebrafish

表4 斑馬魚絞股藍(lán)葉水提物耐受性影響的參數(shù)估計(jì)表Table 4 Parameter estimates of the tolerance of zebrafish larvae in the aqueous extract of gynostemma pentaphyllum leaves

然而，研究中采用MF和GP的藥物處理時(shí)間為24 h，所以藥物劑量濃度的選擇空間較大，為統(tǒng)一進(jìn)行降糖作用評(píng)價(jià)，均選用200、400和800μg/mL的劑量對(duì)基于生理的和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型進(jìn)行降糖作用評(píng)價(jià)。

2.5 MF和GP對(duì)高糖誘導(dǎo)糖代謝異常斑馬魚GLU值的影響

圖4 不同濃度桑葉水提物和絞股藍(lán)葉水提物對(duì)高糖誘導(dǎo)斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.4 Effect of different concentrations of in the aqueous extract of moras folium and gynostemma pentaphyllum leaves on the level of glucose of hyperglycemia-induced zebrafish

2.6 MF和GP對(duì)糖尿病斑馬魚GLU值的影響

不同濃度MF和GP對(duì)胰島損傷型斑馬魚GLU值的影響見(jiàn)圖5。圖5顯示，相比空白組，MC1組斑馬魚GLU值增加了321.36%（p＜0.05）。在造模完成后的藥物干預(yù)治療過(guò)程中，MF-T2、MF-T3和GP-T3聯(lián)合處理組中的斑馬魚均全部死亡，因而未能分析GLU值變化情況，表明基于生理和病理生理的藥物劑量濃度篩選上還存在不一致性，還需開展進(jìn)一步的耐受性分析和藥物劑量篩選。但相比MC1組，MF-T1和GP-T2組斑馬魚GLU值分別降低了28.30%和31.03%，差異均顯著（p＜0.05）。

圖5 不同濃度桑葉水提物和絞股藍(lán)葉水提物對(duì)糖尿病斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.5 Effect of different concentrations of in the aqueous extract of moras folium and gynostemma pentaphyllum leaves on the level of glucose of diabetic zebrafish

3 討論

糖尿病是一種世界性疾病，以糖代謝異常著稱，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可以引起糖耐量受損、胰島素敏感性降低，以及誘發(fā)多種重要臟器衰竭，諸如肝臟、腎臟等。目前，在基礎(chǔ)研究上主要是以大小鼠為對(duì)象構(gòu)建糖尿病病理模型開展藥物篩選和功能評(píng)價(jià)研究，但存在明顯的試驗(yàn)周期長(zhǎng)和成本高等問(wèn)題。斑馬魚是近年來(lái)新興的模式生物，利用斑馬魚構(gòu)建糖尿病模型，具有試驗(yàn)周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)，不僅可以快速開展糖尿病治療藥物篩選或研發(fā)而且通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)研究，可以有效彌補(bǔ)體外實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞試驗(yàn)）和哺乳類動(dòng)物（大小鼠）實(shí)驗(yàn)之間的生物學(xué)斷層。利用斑馬魚開展糖尿病生物模型研究主要是以斑馬魚成魚為對(duì)象，與大小鼠造模方式相近，而采用斑馬魚幼魚建模的研究目前還比較鮮見(jiàn)。

GLU是機(jī)體中提供能量的最基本糖類物質(zhì)，其可以在腸道上皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的輔助下從腸道內(nèi)直接吸收[11]。研究發(fā)現(xiàn)將斑馬魚幼魚直接暴露于GLU溶液中，隨著GLU濃度的增加，斑馬魚GLU水平也會(huì)不斷增加，這與GLU在腸道內(nèi)的直接吸收方式是有關(guān)的，最終造成GLU的供給量超過(guò)它的消耗量，進(jìn)而引起糖代謝異常。ALX是嘧啶的一種含氧衍生物，通過(guò)產(chǎn)生氧自由基可以選擇性地破壞胰島β細(xì)胞，引起細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致胰島素分泌量下降，形成胰島素依賴性糖尿病[12]。研究發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚幼魚直接暴露于ALX溶液中，隨著ALX濃度的增加，斑馬魚GLU水平也在不斷增加。由于并未向斑馬魚提供任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持斑馬魚生存所需的GLU主要是來(lái)源于幼蟲體內(nèi)卵黃囊內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解，而顯著增加的GLU主要是體內(nèi)分解產(chǎn)生的GLU因胰島素分泌不足而未得到有效利用有關(guān)。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)以GLU為營(yíng)養(yǎng)源，再結(jié)合ALX聯(lián)合誘導(dǎo)還可以進(jìn)一步造成提升GLU水平，因而以高濃度GLU與ALX聯(lián)用可以有效構(gòu)建糖代謝異常斑馬魚模型。

MF是我國(guó)傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)作物，是蠶的主要食物，中醫(yī)稱其具有疏散風(fēng)熱，清肺潤(rùn)燥，清肝明目的功效[13]。GP有“南方人參”之稱，具有降血脂，調(diào)血壓防治血栓，調(diào)節(jié)血糖等功效[14]。中醫(yī)講究辨證論治，用證候分型，較為晦澀難懂；西醫(yī)則是辨病論治，以疾病分型，比較具象，注重實(shí)驗(yàn)室結(jié)論。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)步入了整體和系統(tǒng)醫(yī)學(xué)的時(shí)代，向世界介紹中醫(yī)藥，應(yīng)該注重中西醫(yī)并重發(fā)展，同時(shí)借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，開展靶點(diǎn)研究和功能評(píng)價(jià)，促進(jìn)中醫(yī)藥療效具象化辨析論證。研究采用已構(gòu)建的高糖誘導(dǎo)型和胰島損傷型糖代謝異常斑馬魚模型，探討MF和GP兩種藥用植物的葉水提取物對(duì)其糖代謝的綜合作用。研究發(fā)現(xiàn)MF和GP葉水提取物可以降低高糖誘導(dǎo)型和胰島損傷型糖代謝異常斑馬魚GLU水平，在同等劑量作用濃度下，MF的靶向降糖功能明顯強(qiáng)于GP。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在胰島損傷模型中，較高濃度的MF和GP均造成了斑馬魚全部死亡，因而在病理模型適宜劑量濃度選擇方面還需要再進(jìn)一步優(yōu)化。

GLU是最基礎(chǔ)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其進(jìn)入腸道內(nèi)可以直接被吸收，因而MF和GP在本研究中的降糖效應(yīng)與抑制糖類的消化作用是無(wú)關(guān)的，推測(cè)可能的降糖作用機(jī)制與減少GLU腸道吸收量，或者促進(jìn)胰島素分泌，進(jìn)而促進(jìn)體內(nèi)GLU高效利用有關(guān)。MF中包含黃酮、生物堿、多糖等活性成分[15]，GP中包含黃酮、皂苷類、多糖等活性成分[16]。

當(dāng)前以細(xì)胞試驗(yàn)和大小鼠動(dòng)物試驗(yàn)表明，MF和GP具有降糖活性與減少能量物質(zhì)吸收，促進(jìn)能量物質(zhì)消耗有關(guān)。在MF靶向降糖作用研究方面，呂歡[17]以人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞為對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)MF提取物能有效降低人結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞Na+-K+-ATP酶的活性，降低Na+-K+-ATPase、 腸 葡 萄 糖 轉(zhuǎn) 運(yùn) 載 體（sodium/glucose cotransporters，SGLT）1、葡萄糖協(xié)助擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)（facilitative glucose transporters，GLUT）2以及mRNA的基因表達(dá)，表明MF提取物可有效降低GLU的吸收，進(jìn)而減少GLU的來(lái)源。另外，細(xì)胞試驗(yàn)和2型糖尿病大鼠動(dòng)物試驗(yàn)表明MF可顯著提高胰島素抵抗（insulin resistance，IR）的3T3-L1脂肪細(xì)胞GLU消耗量，增強(qiáng)細(xì)胞活力[18-19]，還可以顯著增加骨骼肌組織中胰島素受體底物-1、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）中的p85α、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4（GLUT4）的mRNA及蛋白的表達(dá)[20]，表明MF提取物可以促進(jìn)GLU的利用，增加GLU的消耗。此外，劉洪鳳等[21]研究發(fā)現(xiàn)MF多糖也具有類似作用，可以上調(diào)2型糖尿病大鼠脂肪組織GLUT4基因的表達(dá)，達(dá)到降糖作用。在GP靶向降糖研究方面，王同壯等[22]研究發(fā)現(xiàn)500 mg/kg GP葉水提物可以明顯降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的空腹血糖，明顯逆轉(zhuǎn)骨骼肌GLUT4 mRNA及蛋白的表達(dá)。趙濤等[23]研究發(fā)現(xiàn)400 mg/kg GP總皂苷可以顯著降低胰腺β細(xì)胞凋亡指數(shù)，明顯降低空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)，顯著增加胰島β細(xì)胞功能指數(shù)和定量胰島素敏感性檢測(cè)指數(shù)，表明GP總皂苷可明顯改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，提高GLU利用。研究通過(guò)高糖誘導(dǎo)型和胰島損傷型糖代謝異常斑馬魚靶向降糖作用評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，MF和GP均具有靶向降糖效應(yīng)，但在同等劑量濃度下MF的降糖效應(yīng)明顯強(qiáng)于GP，且其降糖作用可能與減少GLU吸收以及提高GLU的利用有關(guān)。

4 結(jié)論

高濃度GLU（22～30 mg/mL）溶液、ALX（0.04～0.10 mM）藥物、GLU（22 mg/mL）溶液與四氧嘧啶（0.02～0.08 mM）藥物聯(lián)合誘導(dǎo)可顯著增加斑馬魚（5 dpf）GLU水平，可以建立斑馬魚糖代謝異常生物模型。高濃度的MF和GP對(duì)斑馬魚（5 dpf）具有一定殺傷作用，長(zhǎng)時(shí)孵育時(shí)更明顯，但斑馬魚對(duì)GP的耐受性強(qiáng)于MF。MF孵育48 h時(shí)的LC50為5706.06μg/mL，95%可信范圍為4732.39～7067.28μg/mL，GP孵育72 h時(shí)的LC50為9766.18μg/mL，95%可信范圍為7669.52～13927.51μg/mL，按10%～25%LC50推薦MF和GP可用于靶向功效評(píng)價(jià)的適宜的劑量濃度分別為570.61～1426.52μg/mL、976.62～2441.55μg/mL。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，200、400和800μg/mL ML，800μg/mL GP可以顯著降低高糖溶液誘導(dǎo)型斑馬魚GLU水平，200μg/mL MF和400μg/mL GP可以顯著降低胰島損傷型斑馬魚GLU水平，表明MF和GP具有降糖作用，但在同等劑量濃度下MF的降糖作用明顯強(qiáng)于GP。