劉會(huì) 龐軍 譚洪文 田野 陳保林

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

近年來(lái)，急性心肌梗死(acute myocardial infarction,MI)發(fā)病率明顯上升，成為全世界致死和致殘的首要疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。心肌梗死過(guò)程中，心肌細(xì)胞壞死、凋亡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞銳減，非梗死區(qū)心肌細(xì)胞擴(kuò)大、間質(zhì)纖維化，心肌收縮力下降從而引起心功能不全。減少心肌細(xì)胞壞死、凋亡，抑制心肌纖維化意義重大。賴(lài)氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)具有穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)免受基質(zhì)金屬蛋白酶降解的功能[1]，LOX表達(dá)量與心肌纖維化的程度相關(guān)[2]。目前有研究[3]表明，LOX參與冠心病等疾病的發(fā)生及發(fā)展。Xiao Y等復(fù)制獼猴心肌梗死模型，提取梗死區(qū)心肌組織測(cè)定LOX RNA和蛋白，梗死區(qū)心肌組織LOX表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加。目前的研究?jī)H涉及LOX在急性心肌梗死模型中的表達(dá)情況，而藥物是否可逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死心肌中LOX表達(dá)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?；谏鲜觯緦?shí)驗(yàn)旨在觀察阿托伐他汀對(duì)急性心肌梗死小鼠心肌組織LOX表達(dá)的影響。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 8周齡SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠45只 [合格證編號(hào)：SCXK(京)2006-000]置于室溫22℃～25℃、相對(duì)濕度為45%左右的動(dòng)物房?jī)?nèi)顆粒飼料(許可證號(hào)：SCXK-(粵)2008-0002)飼養(yǎng)，均自由飲水。隨機(jī)選取30只制作急性心肌梗死模型，2%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定在手術(shù)板上，沿左側(cè)胸大肌外側(cè)緣做1 cm皮膚切口，鈍性分離胸肌，將蚊式血管鉗插入左側(cè)第4或第5肋間，迅速撐開(kāi)肋間擠出心臟，用6-0絲線于左冠狀動(dòng)脈前降支處打結(jié)，根據(jù)左室前壁心肌顏色變化明確缺血是否成功，然后將心臟送回胸腔，縫合胸部皮膚切口之后將小鼠放回籠中(JONS法)[4]。心肌梗死模型小鼠分為2組，每組15只。MI組(予等量生理鹽水灌胃)；治療組(急性心肌梗死模型建立后予阿托伐他汀2 mg.kg-1.d-1灌胃)。另取15只健康雄性C57BL/6小鼠設(shè)為對(duì)照組。

1.2方法 (1)組織標(biāo)本處理和左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)測(cè)定 4周末，2%異氟烷吸入麻醉小鼠，仰臥位固定在手術(shù)板上開(kāi)胸取出完整的心臟，肝素鹽水洗凈心腔內(nèi)殘流血液，去除心外膜、右心室和左右心房，保留室間隔，用濾紙吸去多余的水份，OCT包埋后迅速凍于液氮中，冰凍切片機(jī)沿左室長(zhǎng)軸將心肌組織切成7 μm的切片；部分心肌分成若干部分裝于EP管中，其后凍存于液氮中檢測(cè)RNA和蛋白質(zhì)。(2)TUNEL染色：7 μm的心肌組織冰凍切片用4%的多聚甲醛溶液固定10 min后，PBS漂洗3次，TritonX100穿膜5 min，PBS漂洗3次，加入混合好的TUNEL染液在37℃下反應(yīng)60 min，PBS漂洗3次，封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照，Image Pro軟件計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。每個(gè)切面取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定：參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取凍存左心室心肌組織總RNA，紫外分光光度測(cè)定其260 nm和280 nm的吸光度值(A)，計(jì)算總RNA的純度。A260/A280在1.9-2.1之間認(rèn)為純度符合要求。依據(jù)公式(RNA樣品濃度=A260×40 μg/L×稀釋倍數(shù))計(jì)算RNA樣本濃度，配制出50 μg/L 的20 μL RNA樣本稀釋液，取5 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用Icyclery IQ real-time PCR儀檢測(cè)LOX和MMP-2 mRNA表達(dá)水平。所有引物均參造Genebank提供的序列，由大連晨鈺生物有限公司合成。β肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物：5’-TTGTGCCTCTGTGTCGCATCCT-3’，下游引物：5’-GCTGACTAGCAGTCACTGCTA-3’，擴(kuò)增片段為154bp；LOX上游引物:5’- ATGGTCGCTCGCAGATGATCG -3’，下游引物：5’- AGCTGTGAGATCTTCTCTGGC -3’，擴(kuò)增片段為246bp；MMP-2上游引物:5’- ATGTCTGCTGATCGTTCATCG -3’，下游引物：5’- ACGTGCGAGACTGAGT GTAGC -3’，擴(kuò)增片段為348bp。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃×10 min，變性95 ℃×10 sec，退火/延伸60 ℃×45 sec，循環(huán)38次。(4)Western Blot法檢測(cè)：參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠左心室心肌組織全蛋白，測(cè)定蛋白濃度。取50 μg全蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，15%脫脂牛奶室溫下封閉60 min，將膜與特異性抗體在4 ℃結(jié)合過(guò)夜(β-actin：鼠抗單克隆抗體，1:2 000；LOX：羊抗人多克隆抗體，1:500；MMP-2：鼠抗單克隆抗體，1:500；)，次日PBST漂洗10 min×3次，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二級(jí)抗體(β-actin：山羊抗小鼠，1:20 000；LOX：鼠抗羊，1:500； MMP-2：兔抗鼠，1:500；)室溫下?lián)u床上反應(yīng) 60 min，PBST漂洗10 min×3次，加入ECL液，曝光、顯影、定影，用Bandscan軟件分析條帶像素灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般情況比較 對(duì)照組15只小鼠全部存活，小鼠活潑；MI組存活13只；治療組存活14只；MI組及治療組小鼠活動(dòng)較對(duì)照組稍差。解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)心臟破裂、腹水。

2.2各組小鼠心肌組織TUNEL染色 TUNEL染色顯示，對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)為(6±3.0)/高倍鏡視野，MI組小鼠梗死周邊區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)為(18±7.0)/高倍鏡視野(P<0.05)，治療組小鼠梗死周邊區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)為(12±5.0)/高倍鏡視野，比MI組減少了33%(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

注：a.對(duì)照組；b.MI組；c.治療組。圖1

表1 各組小鼠左心室心肌組織TUNEL染色

2.3各組小鼠左心室心肌組織LOX和MMP-2 mRNA表達(dá) 與對(duì)照組比較，MI組小鼠心肌組織LOX和MMP-2 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與MI組比較，治療組小鼠心肌組織LOX和MMP-2 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各小鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，MI組小鼠心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與MI組比較，治療組小鼠心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

注：LOX：賴(lài)氨酰氧化酶；MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶-2； 1：對(duì)照組；2：MI組；3：治療組。圖2 各組小鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達(dá)

表3 各組小鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達(dá)

2.5小鼠左心室心肌組織LOX與MMP-2指標(biāo)的關(guān)系 MI組小鼠梗死周邊區(qū)域細(xì)胞凋亡數(shù)與左心室心肌組織LOX(r= 0.79，P= 0.03)、 MMP-2(r= 0.81，P= 0.02)表達(dá)均呈正相關(guān)。

3 討 論

隨著人口老年化的發(fā)展，心肌梗死發(fā)病率居高不下，心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致心肌收縮力下降、心肌功能障礙、室性心律失常和心源性猝死[5]，梗死區(qū)及非梗死區(qū)心肌組織節(jié)段及心肌厚度均發(fā)生異常變化，心肌細(xì)胞凋亡及壞死進(jìn)一步加重心肌纖維化[6]，因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化有助于改善心功能及遠(yuǎn)期預(yù)后。目前研究表明，LOX參與冠心病等疾病的發(fā)生及發(fā)展。LOX在心肌重塑過(guò)程中發(fā)揮不可替代的作用。在瓣膜性心臟病心肌組織中，LOX表達(dá)增加促進(jìn)血管緊張素-II介導(dǎo)的心肌組膠原纖維及彈性纖維增加，進(jìn)一步促進(jìn)心臟擴(kuò)大及心功能不全[7]。制作主動(dòng)脈瘺介導(dǎo)的容量負(fù)荷增加型心力衰竭小鼠模型，發(fā)現(xiàn)心肌組織LOX表達(dá)明顯增加，而且LOX表達(dá)增加促進(jìn)心肌組織膠原纖維表達(dá)及心肌纖維化[8]。此外有研究表明，心肌梗死動(dòng)物模型心肌組織LOX表達(dá)明顯上調(diào)，心肌梗死8周后，心肌組織膠原纖維明顯增加，基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達(dá)明顯下調(diào)，金屬蛋白酶抑制因子-1表達(dá)無(wú)明顯變化[9]。復(fù)制獼猴心肌梗死模型，提取心肌組織RNA和蛋白，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)心肌組織LOX表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加，此外，心肌組織I型及III型膠原纖維也明顯增加[3]。以上研究均表明，LOX在急性心肌梗死心肌組織中表達(dá)增加。我們的實(shí)驗(yàn)表明，MI組小鼠心肌組織LOX mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高，TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)也增加，與之前的研究結(jié)果一致。因此，對(duì)LOX的調(diào)節(jié)與干預(yù)在急性心肌梗死的治療過(guò)程中具有非常重要的意義。

他汀類(lèi)藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于冠心病患者并取得明顯效果，可改善心肌梗死后心室重塑[10]，然而他汀類(lèi)藥物的多效性是否可通過(guò)調(diào)節(jié)LOX表達(dá)而保護(hù)受損的心肌目前研究仍然較少?，F(xiàn)有研究表明，阿托伐他汀可通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)變化而顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化兔心肌膠原蛋白的表達(dá)，從而緩解心肌纖維化[11]。既往我們的研究表明，阿托伐他汀可下調(diào)糖尿病心肌病小鼠心肌組織LOX mRNA及蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[12]。此外，在慢性心力衰竭小鼠心肌組織中，他汀可通過(guò)調(diào)節(jié) LOX-p38-MMP-9信號(hào)軸發(fā)揮心肌保護(hù)作用[13]。此外，有研究表明，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制急性心肌梗死小鼠模型，發(fā)現(xiàn)心肌梗死周邊區(qū)域及梗死區(qū)域的心肌組織LOX RNA及蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加，梗死區(qū)域心肌組織纖維化明顯增加，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路促進(jìn)LOX表達(dá)增加從而促進(jìn)促進(jìn)心肌纖維化及心臟重塑，引起心臟擴(kuò)大及心功能不全，加入LOX的特異性抑制劑β-氨基丙后心肌梗死區(qū)域的LOX表達(dá)下降，心肌纖維化減輕，心功能不全好轉(zhuǎn)[14]。此外，TGF-β信號(hào)通路還可上調(diào)LOX的表達(dá)促進(jìn)擴(kuò)張型心肌病心肌組織的III型膠原纖維表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MI組小鼠梗死周邊區(qū)域細(xì)胞凋亡數(shù)增加，心肌組織LOX、MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MI組小鼠梗死周邊區(qū)域細(xì)胞凋亡數(shù)與左心室心肌組織LOX和MMP-2表達(dá)呈正相關(guān)。故我們推測(cè)，MI小鼠左心室心肌組織MMP-2表達(dá)與LOX表達(dá)變化有關(guān)。應(yīng)用阿托伐他汀干預(yù)MI小鼠后，梗死周邊區(qū)域細(xì)胞凋亡數(shù)下降，心肌組織LOX、MMP-2 mRNA蛋白表達(dá)下降。阿托伐他汀可逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死小鼠心肌組織LOX表達(dá)，LOX可調(diào)節(jié)MI小鼠心肌組織MMP-2表達(dá)。阿托伐他汀是否可通過(guò)別的信號(hào)通路調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)，本研究未涉及。

綜上所述，阿托伐他汀可下調(diào)急性心肌梗死小鼠心肌組織LOX表達(dá)。這可能是阿托伐他汀治療急性心肌梗死又一依據(jù)。