巫 青，楊尚霖，陳俊鵬，謝學(xué)羿，溫順前

（佛山市第二人民醫(yī)院肝膽外科，佛山 528000）

惡性腫瘤通過血管吸收營養(yǎng)和氧氣以支持腫瘤快速生長，同時也利用血管進(jìn)行擴散轉(zhuǎn)移，其轉(zhuǎn)移關(guān)鍵取決于腫瘤細(xì)胞穿透內(nèi)皮層進(jìn)入和移出脈管系統(tǒng)的速度，即內(nèi)滲和外滲［1］。腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的主要細(xì)胞，其相互作用貫穿于腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程［2］。盡管有證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞可以通過細(xì)胞間的相互作用和旁分泌效應(yīng)，以及釋放多種可以增強腫瘤侵襲性的生長因子、趨化因子和基質(zhì)降解酶，來與局部微環(huán)境相互作用［3］，但是在這個過程中腫瘤細(xì)胞將誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)什么樣的變化并不清楚。因此，研究這個過程中內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能是非常重要的。本試驗將人肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（HepG2 conditioned medium，HepG2-CM）與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）共培養(yǎng)，模擬腫瘤微環(huán)境，觀察HepG2-CM對HUVEC細(xì)胞形貌和超微結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2和HUVEC細(xì)胞為本實驗室凍存，胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，M199培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺、青鏈霉素購自美國Hyclone公司，培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）購自美國Thermo microscope公司，掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）購自日本日立高新技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的M199培養(yǎng)液，在含5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中對HUVEC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 HepG2-CM的制備

參考Pan等［4］的方法，收集處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106個/mL，用含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL的M199培養(yǎng)液于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗3遍后加入無血清培養(yǎng)基過夜饑餓處理，次日收集HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液，2 000 r/min離心5 min，經(jīng)直徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾，以除去漂浮的腫瘤細(xì)胞，配成50%的體積比備用。

1.2.3 HepG2-CM誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

取對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/mL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，貼壁生長12 h后加入2 mL HepG2-CM，對照組只加無血清培養(yǎng)液。將其分別作用HUVEC細(xì)胞24 h，用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的生長狀況和形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.2.4 SEM觀察HUVEC細(xì)胞的形貌

在6孔板內(nèi)放入22 mm×22 mm的無菌云母玻片，每孔加入1×104個/mL的HUVEC細(xì)胞懸液2 mL，使細(xì)胞均勻爬片。貼壁生長12 h后，試驗組加入2 mL HepG2-CM，對照組只加無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將玻片從培養(yǎng)孔取出，用PBS緩沖液于搖床上輕輕洗3遍，每遍5 min，然后用2.5%的戊二醛浸沒玻片，置于4℃冰箱固定過夜，超純水清洗細(xì)胞3次，每次5 min，以除去固定液；使用30%、50%、70%、90%、100%的梯度乙醇脫水，每級梯度處理10 min；樣品經(jīng)由無水乙醇與醋酸異戊酯（體積比為1∶1）的混合液過渡，并轉(zhuǎn)入純醋酸異戊酯以置換酒精，每次約10 min；按“進(jìn)氣-浸泡-置換（3次）-升溫-放氣”等步驟進(jìn)行CO2臨界點干燥；將干燥后的樣品轉(zhuǎn)移到銅臺上，置于離子濺射儀中，抽真空20 min，噴金10 min。

1.2.5 AFM觀察HUVEC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

在6孔板內(nèi)放入22 mm×22 mm的無菌云母玻片，每孔加入1×104個/mL的HUVEC細(xì)胞懸液2 mL。細(xì)胞均勻爬片后，試驗組加入2 mL HepG2-CM，對照組只加無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將玻片取出，用PBS于搖床上輕輕洗3遍，然后用4%的多聚甲醛固定15 min，蒸餾水輕輕沖洗3次，室溫自然干燥后立即進(jìn)行AFM掃描。將載有細(xì)胞樣品的玻片固定在AFM的掃描臺上，用監(jiān)視器定位待掃描的樣品區(qū)域，對樣品進(jìn)行掃描成像。采用100 μm掃描器和UL2.0B硅探針，力常數(shù)為2.8 N/m，在空氣中室溫下進(jìn)行掃描，以接觸模式成像。所有圖像僅經(jīng)儀器配置軟件（IP 2.1）平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 倒置顯微鏡觀察HUVEC細(xì)胞形態(tài)

在倒置顯微鏡下觀察各組HUVEC細(xì)胞形態(tài)的變化（圖1）。正常情況下，HUVEC細(xì)胞呈梭形致密排列，細(xì)胞間緊密連接，鑲嵌形成“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)；HepG2-CM誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞伸長，呈長梭形，黏附減弱，細(xì)胞間隙更疏松。

圖1 倒置顯微鏡觀察HUVEC細(xì)胞形態(tài)（200×）Fig.1 The morphology of HUVEC cells was observed by inverted microscope (200×)

2.2 SEM觀察各組HUVEC細(xì)胞形貌

利用高分辨率SEM對HUVEC細(xì)胞成像，觀察細(xì)胞形貌的變化，結(jié)果如圖2所示：對照組HUVEC細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞膜表面有顆粒樣物質(zhì)；HepG2-CM刺激后HUVEC細(xì)胞伸長，細(xì)胞膜向四方伸展，細(xì)胞表面有很多顆粒樣物質(zhì)突起，“偽足”樣突起明顯增多。

圖2 SEM觀察HUVEC細(xì)胞形貌（5 000×）Fig.2 The morphology of HUVEC cells was observed by SEM (5 000×)

2.3 AFM觀察HUVEC細(xì)胞形貌

通過AFM觀察各組HUVEC細(xì)胞形貌圖和對應(yīng)的拓補圖可發(fā)現(xiàn)（圖3），對照組HUVEC細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核突出，細(xì)胞飽滿，邊緣相對平整，無明顯細(xì)胞膜延伸，相鄰細(xì)胞之間緊密依靠，細(xì)胞黏附排列致密，這是無HepG2-CM刺激狀態(tài)下HUVEC細(xì)胞的形貌特征。由于HepG2-CM的刺激，細(xì)胞運動活躍，HUVEC細(xì)胞伸長，呈長梭形，細(xì)胞核塌陷，黏附減弱，細(xì)胞膜向四方伸展，邊緣模糊，與相鄰細(xì)胞之間連接疏散，邊緣可見明顯“偽足”樣突起（圖3b黑色箭頭）。

圖3 AFM觀察HUVEC細(xì)胞形貌Fig.3 The morphology of HUVEC cells was observed by AFM

2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析

圖4為各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖和細(xì)胞膜表面粒徑分布圖。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞邊緣相對平整，表面顆粒較?。▓D4a），HepG2-CM作用后細(xì)胞邊緣不平整，出現(xiàn)“偽足”樣突起（圖4b箭頭所示），表面顆粒變大，粒徑分布明顯右移（圖4c、4d）。

圖4 各組HUVEC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖和細(xì)胞膜表面粒徑分布圖Fig.4 Ultrastructural and particle size distribution of cell membrane surface of HUVEC in each group

2.5 細(xì)胞膜表面粗糙度分析

用AFM自帶軟件對上述細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行測量，得到超微結(jié)構(gòu)幾何參數(shù)值的不同數(shù)值：高低差（peak to valley roughness，Rp-v）、均方根粗糙度（root-mean-square roughness，Rq）、平均粗糙度（Average roughness，Ra）、平均高度（Meant Ht）、中位數(shù)高度（Median Ht）均反應(yīng)細(xì)胞膜表面粗糙度的變化。分別測量每組4個細(xì)胞的不同區(qū)域，對這些數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示（圖5），HepG2-CM處理前后幾何參數(shù)均發(fā)生明顯變化，Rp-v分別為（454.83±29.99）nm和（501.28±11.78）nm，P=0.028；Rq分別為（32.84±4.70）nm和（45.03±3.84）nm，P=0.007；Ra分別為（25.06±4.09）nm和（34.39±3.58）nm，P=0.014；Meant Ht分別為（204.03±11.65）nm和（301.48±12.80）nm，P=0；Median Ht分別為（206.55±7.46）nm和（313.25±5.89）nm，P=0。結(jié)果表明，HepG2-CM處理后細(xì)胞表面粗糙度明顯增加。

圖5 各組HUVEC細(xì)胞膜表面粗糙度的分析Fig.5 Analysis of surface roughness of HUVEC cell membrane in each group

3 討論

轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的首要原因，其過程包括原位浸潤、腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲、循環(huán)系統(tǒng)存活、腫瘤細(xì)胞外滲、轉(zhuǎn)移灶形成等［5］。移行的腫瘤細(xì)胞通過內(nèi)滲進(jìn)入血管內(nèi)離開原發(fā)腫瘤，通過循環(huán)擴散到全身，最后定植到提供適當(dāng)微環(huán)境的遠(yuǎn)處器官中［6］。其中，腫瘤細(xì)胞穿透內(nèi)皮層進(jìn)入和移出脈管系統(tǒng)，即內(nèi)滲和外滲是重要步驟［1］。在這個過程中必然引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化，許多研究焦點都集中于腫瘤細(xì)胞如何穿透內(nèi)皮層，而未觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的變化。因此，研究腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞形貌和超微結(jié)構(gòu)的變化具有很重要的意義。

腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的相互作用始終貫穿于腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過程，內(nèi)皮細(xì)胞可以向腫瘤細(xì)胞提供一些信號來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［7］，腫瘤細(xì)胞也可以通過多種方式誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。一方面，來自腫瘤細(xì)胞的外泌體通過觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和減少緊密連接相關(guān)蛋白破壞血管完整性，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生［6］。Lin等［6］不僅在體外試驗中用外泌體處理單層內(nèi)皮細(xì)胞，使其通透性增加，而且在體內(nèi)試驗中將其注射到小鼠體內(nèi)，也增加了血管通透性和腫瘤轉(zhuǎn)移。另一方面，腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基中富含促血管內(nèi)皮生長因子，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［8-10］。Jean等［11］將釋放血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的腫瘤細(xì)胞與體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些腫瘤細(xì)胞先黏附到內(nèi)皮細(xì)胞層，然后再從中穿過。我們之前的研究也顯示，HepG2-CM內(nèi)豐富的VEGF能誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞遷移，且引起細(xì)胞骨架重排［4］。VEGF又稱血管通透因子（vascular permeability factor，VPF），是目前發(fā)現(xiàn)特異性最高、促血管作用最強的促血管生成可溶性因子。它通過直接與內(nèi)皮細(xì)胞上相應(yīng)受體（如Flt-1和VEGFR-2）高親和力結(jié)合，啟動其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而激活內(nèi)皮細(xì)胞，不僅可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，還可以增加血管通透性［12］。

為了更好地模擬體內(nèi)腫瘤組織復(fù)雜的微環(huán)境，試驗采用間接共培養(yǎng)的方法構(gòu)建了HepG2-CM和HUVEC細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型，通過高分辨率的SEM及AFM初步觀察了HepG2-CM誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞形貌及超微結(jié)構(gòu)的變化，并對其細(xì)胞膜表面粗糙度進(jìn)行分析。結(jié)果表明，HepG2-CM誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞膜向四方伸展，出現(xiàn)明顯“偽足”樣突起，細(xì)胞膜表面粗糙度增加，減弱了細(xì)胞的黏附及細(xì)胞之間的緊密連接效果。這些是內(nèi)皮細(xì)胞運動活躍的表現(xiàn)，表明HepG2-CM刺激了HUVEC細(xì)胞的活性［13］。研究表明，細(xì)胞間緊密連接蛋白與胃腸道腫瘤和肝臟疾病密切相關(guān)［14］，尤其是腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，緊密連接蛋白的下調(diào)或丟失會改變細(xì)胞遷移、增殖、極性和分化，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展［15］。血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)有緊密連接、黏附連接、縫隙連接等，其中緊密連接在血管完整性中起重要作用，并控制單層內(nèi)皮的通透性［6］。高劑量貝伐單抗通過TGF-β1信號通路降低緊密連接蛋白CLDN5的表達(dá)，從而增強內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、侵襲和滲漏能力［16］，而納米金通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上的VE-鈣黏蛋白水平來加強緊密連接，降低血管通透性［17］。Escribano等［1］通過建立內(nèi)皮細(xì)胞單層計算模型來研究內(nèi)皮細(xì)胞間隙形成的機制，結(jié)果顯示，機械力的平衡驅(qū)動內(nèi)皮間隙的形成，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的外滲。他認(rèn)為，力學(xué)作用讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞會被這樣的力量沿著不同的方向拉扯推動，最終導(dǎo)致細(xì)胞之間發(fā)生裂痕，出現(xiàn)了暫時的空隙，且隨著內(nèi)皮細(xì)胞連接變得穩(wěn)定，縫隙打開的頻率會降低。

綜上所述，HUVEC出現(xiàn)上述形貌和超微結(jié)構(gòu)的變化可能是這個過程中HepG2-CM誘導(dǎo)細(xì)胞遷移引起力學(xué)的變化導(dǎo)致細(xì)胞之間出現(xiàn)了暫時的空隙，破壞了內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，增加了血管通透性。腫瘤轉(zhuǎn)移時腫瘤細(xì)胞如何穿越內(nèi)皮細(xì)胞屏障是關(guān)鍵，也是防治腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點［18］。因此，對內(nèi)皮細(xì)胞形貌和超微結(jié)構(gòu)的研究將有助于我們進(jìn)一步理解腫瘤微環(huán)境中血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，為抗腫瘤血管生成的研究提供思路。