侯光生，閆貴云，李 欣，喬麟軼，常利芳，張曉軍，暢志堅(jiān)

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801)

小麥(TritiumaestivumL.，2n = 6x = 42，AABBDD) 是中國三大糧食作物之一，全國40%以上的人口以小麥作為主食。小麥的安全生產(chǎn)與產(chǎn)量提高，對促進(jìn)中國糧食安全和保障市場需求具有重要影響[1]。穗粒數(shù)是影響小麥產(chǎn)量的三大要素之一，一直以來都是遺傳育種學(xué)家研究的焦點(diǎn)[2]。正常情況下，普通小麥的每一朵小花之內(nèi)都包含1個雌蕊和3個雄蕊，最終發(fā)育成1粒種子[3]。陳濟(jì)世等[4]最早報道了1種生有3個雌蕊的小麥材料，并將之命名為“三粒小麥”，其主要特點(diǎn)是每朵小花都包含3個雌蕊和3個雄蕊，比正常小麥多出2個雌蕊，且每朵小花都可以發(fā)育成3粒種子。

40余年來，國內(nèi)外已對小麥三雌蕊性狀進(jìn)行了大量研究。王宏霞等[5]通過SSR標(biāo)記分析三雌蕊性狀的可能來源。Peng[6-7]等證實(shí)了三雌蕊性狀是受1對顯性核質(zhì)基因控制，為三雌蕊性狀的遺傳分析和染色體定位奠定了基礎(chǔ)。Yang等[8]對三雌蕊突變體中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了鑒定，Wei等[9]分析了可能與三雌蕊性狀相關(guān)聯(lián)的WAG-2D基因的功能，為三雌蕊基因克隆提供了有用的信息。Watanabe等[10]將三雌蕊突變體與具有藍(lán)粒糊粉層基因的品種雜交，對三雌蕊性狀的發(fā)育起源進(jìn)行了研究。Peng等[7]將三雌蕊基因定位在小麥4B染色體上。Wang等[11]利用中國春2D缺失系將控制小麥三雌蕊性狀的基因定位到了染色體2DL的末端區(qū)域。但目前對于小麥三雌蕊性狀基因的克隆和三雌蕊性狀形成原因及其遺傳機(jī)理尚無明確結(jié)論，在生產(chǎn)上的應(yīng)用也無較大進(jìn)展。

CH257為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院利用‘三粒小麥’與普通小麥品系‘石優(yōu)20’回交3次后選育的一個三雌蕊材料，本研究通過對CH257與普通小麥中國春構(gòu)建的后代群體進(jìn)行遺傳分析，并利用90K SNP芯片掃描結(jié)合分離群體分組分析法(bulked segrgant analysis，BSA)進(jìn)行基因定位和連鎖標(biāo)記開發(fā)，以期為合理有效地利用三雌蕊小麥種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)使用組合“CH257×中國春”的F1、F2、BC1及F3進(jìn)行三雌蕊性狀的遺傳分析，CH257來源于組合‘三粒小麥/石優(yōu)20*3’的F5選系。中國春(Chinese Spring)小麥種子由電子科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊足君教授惠贈。其他實(shí)驗(yàn)材料均來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院。

1.2 遺傳群體構(gòu)建

將CH257與中國春進(jìn)行正反雜交構(gòu)建F1群體，F(xiàn)1世代單株套袋自交，收獲種子后播種構(gòu)建F2分離群體，F(xiàn)2群體單株編號掛牌后，于4～5葉期每株取5 cm長葉片置于2 mL離心管中，采用CTAB法[12]提取基因組DNA。收獲后每株取40粒種子播種于溫室，構(gòu)建F2:3群體，用于推測F2代基因型。

1.3 遺傳群體表型調(diào)查

田間性狀統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)收集可以在小麥的開花期或成熟期(4月底或5月初)兩個時期進(jìn)行。在開花期進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，如果有3個雌蕊在一朵小花里面則被認(rèn)為是三雌蕊性狀，如果只有1個雌蕊和3個雄蕊在一朵小花里面，則被認(rèn)為是正常雌蕊，即正常小麥性狀。

1.4 BSA法混池及SNP芯片掃描

根據(jù)F2:3單株表型結(jié)果，在“CH257×中國春”組合中選取三雌蕊和單雌蕊各40個F2單株，按照BSA法[13]分別取每個F2單株等量DNA組建三雌蕊和單雌蕊DNA混合池，利用illumina Wheat 90K SNP芯片分別對CH257、‘中國春’、三雌蕊混合池和單雌蕊混合池進(jìn)行芯片掃描，委托中玉金(北京)生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行SNP分型。掃描結(jié)果使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[14]。

1.5 連鎖標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)SNP分析結(jié)果，確定相關(guān)基因所在染色體區(qū)段。利用在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/?term=wheat)中檢測中國春基因組(IWGSC v1.0)數(shù)據(jù)，利用SSR Hunter 1.3檢索該序列片段中的SSR，提取所有SSR序列兩側(cè)各300 bp序列，利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物(表1)，Tm值為55 ℃，引物長度為18～22 bp。設(shè)計(jì)的引物在PCR儀(C1000型，美國伯樂公司)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物加入2 μL 6×Loading Buffer，混勻后采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(220 V恒壓)，銀染法染色，顯影后，在膠片觀察燈上觀察電泳結(jié)果，照相并對F2群體進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)。

表1 16個在小麥CH257和‘中國春’上有擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 三雌蕊基因的遺傳分析

利用CH257與‘中國春’進(jìn)行正交構(gòu)建F1群體，其F1再與雙親進(jìn)行回交，并對F1、BC1F1和F2群體的性狀進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果如表2。其中，F(xiàn)1群體共35個單株，且都為三雌蕊性狀；BC1(CH257/中國春//中國春)群體共126株，65株為三雌蕊，61株為單雌蕊，卡方檢驗(yàn)符合1∶1；BC1(CH257/中國春//CH257)群體共85株，全部為三雌蕊；F2代群體共312株，224株為三雌蕊，88株為單雌蕊，卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明三雌蕊:單雌蕊符合3∶1比例。以上遺傳結(jié)果分析表明在CH257中存在一個顯性單基因位點(diǎn)控制小麥三雌蕊發(fā)育的性狀。

2.2 三雌蕊基因SNP芯片分析

運(yùn)用90K SNP基因芯片分別對‘CH257/中國春’組合兩個極端混池以及雙親進(jìn)行全基因組檢測，在兩個混池及雙親間均表現(xiàn)差異的SNP進(jìn)行比對，獲得兩個混池和兩個親本間共同表現(xiàn)差異的SNP共有557個，根據(jù)90K SNP基因芯片遺傳整合圖譜信息，將表現(xiàn)差異的位點(diǎn)整合到小麥的21條染色體上。由圖1，A 可知，3D、4D、6D、7D四條染色體上SNP位點(diǎn)差異不明顯；2D染色體上差異位點(diǎn)分布多達(dá)247個，約占總SNP數(shù)量的44%；3A、5A、6B三條染色體上均分布著12個差異位點(diǎn)；2A染色體上分布32個位點(diǎn)，約占總SNP數(shù)量的6%；2B染色體上分布著25個位點(diǎn)，約占總SNP數(shù)量的4%；其余的SNP差異位點(diǎn)分布在其他染色體上。另外，由圖1，B初步推測控制三雌蕊性狀的基因位于2D染色體的長臂上。

表2 遺傳群體性狀分析

2.3 連鎖標(biāo)記的篩選

根據(jù)SNP芯片檢測結(jié)果，在2D染色體上設(shè)計(jì)了48對引物，設(shè)計(jì)的引物先在親本CH257和‘中國春’間篩選，共篩選出親本間多態(tài)性引物16對；用這16對引物擴(kuò)增11株三雌蕊和11株單雌蕊組成的小群體，獲得5對連鎖的標(biāo)記，分別為2DL07、2DL17、2DL22、2DL25和2DL38。

圖1 SNP差異位點(diǎn)分布位置(A)以及SNP位點(diǎn)在2D染色體上的分布(B)Fig.1 The physical distribution of SNP difference sites (A) and SNP sites are distributed on the chromosome 2D (B)

利用篩選出的5個多態(tài)性標(biāo)記對F2群體的312個單株進(jìn)行了PCR擴(kuò)增(圖2)，與三雌蕊親本CH257帶型相同的個體基因型記為“A”，二者的雜合帶型記為“H”，與單雌蕊親本‘中國春’帶型相同的個體基因型記為“B”。讀帶結(jié)果(表3)顯示， 5個標(biāo)記的基因型數(shù)量分離比例均符合1∶2∶1。根據(jù)小群體篩選結(jié)果推測，上述5個標(biāo)記與CH257中的三雌蕊控制基因Pis-CH257均存在連鎖關(guān)系。

2.4 遺傳圖譜構(gòu)建

利用5個連鎖標(biāo)記檢測全部F2群體，根據(jù)分子標(biāo)記檢測結(jié)果和田間表型鑒定結(jié)果，使用Joinmap4.0軟件計(jì)算連鎖距離，最終將CH257中控制雌蕊發(fā)育的基因Pis-CH257定位于2DL染色體2DL22-2DL25之間，2DL22和2DL25與Pis-CH257的遺傳距離分別為1.1cM和2.3cM。使用Mapchart2.3繪制遺傳連鎖圖譜(圖3，A)，通過查詢了小麥2D染色體的長度和5個標(biāo)記的物理位置和已有報道的標(biāo)記的物理位置(圖3，B)繪制了Pis-CH257的物理圖譜[15](圖3，C)。

M. Marker；A.三雌蕊親本(CH257)；B.單雌蕊親本(中國春)；1～11.三雌蕊單株；12～22.單雌蕊單株圖2 Pis-CH257連鎖SSR標(biāo)記在“CH257×中國春”F2代三雌蕊與單雌蕊小群體擴(kuò)增結(jié)果M. DNA size marker; A. Three pistil parent (CH257); B. Single pistil parent (Chinese Spring); 1-11. Three pistil per plant; 12-22. Single pistil per plantFig.2 Amplification results of Pis-CH257-linked SSR markers in three pistil and single pistil small population of “CH257×CS” F2

表3 Pis-CH257連鎖SSR對F2群體的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 Pis-CH257遺傳連鎖圖譜(A)、Pis-CH257已有標(biāo)記物理圖譜(B)和已有標(biāo)記比較物理圖譜(C)Fig.3 Pis-CH257 genetic linkage map (A), Pis-CH257 existing marker physical map (B) and existing marker physical map (C)

3 討 論

與其他谷類作物一樣，小麥花器官的發(fā)育直接影響谷物產(chǎn)量，然而這種花器官異?？梢詾楦牧夹←湲a(chǎn)量提供獨(dú)特的遺傳資源[16]。解析小麥花發(fā)育機(jī)制可以促進(jìn)雜交小麥的發(fā)展，增加小麥的產(chǎn)量構(gòu)成[17-19]。對控制小麥花發(fā)育基因的分子特征和調(diào)控因子的鑒定，可以改變小麥育種策略和加快培育高產(chǎn)小麥品種進(jìn)程[20-21]。一個小花中發(fā)育出3個雌蕊在小麥遺傳育種研究中具有極大的利用價值，不僅能夠?yàn)檠芯恐参锘ㄆ鞴侔l(fā)育的機(jī)理和遺傳機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)材料，而且對小麥雜種優(yōu)勢利用和產(chǎn)量的提高也具有一定的作用[21]。關(guān)于三雌蕊性狀的遺傳機(jī)制，馬守才等[22-23]的研究認(rèn)為控制三雌蕊小麥的基因有隱性和顯性兩種，且受細(xì)胞質(zhì)影響嚴(yán)重；武軍等[24]、Peng等[6-7]研究認(rèn)為，三雌蕊基因受一對顯性單基因控制；但Zhu等[25]的研究認(rèn)為三雌蕊性狀受單個半顯性基因控制。本研究通過對“CH257/中國春”組合后代群體進(jìn)行遺傳分析后，發(fā)現(xiàn)CH257的三雌蕊性狀可以穩(wěn)定遺傳給后代，而且在CH257中控制三雌蕊性狀的基因是一個顯性單基因。

SNP芯片結(jié)合傳統(tǒng)的分離群體分組分析法(BSA)，可以快速檢測2個不同表現(xiàn)型構(gòu)建的混合池間的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)度高的SNP變異，確定其所在染色體區(qū)段，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)與目標(biāo)基因位點(diǎn)連鎖的特異性PCR標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)性狀控制基因的快速定位[26-27]。本研究采用90K SNP芯片結(jié)合BSA法，將CH257中控制三雌蕊性狀的基因Pis-CH257初步定位在2D染色體長臂上，之后利用在該區(qū)段開發(fā)的SSR標(biāo)記將其定位于兩個SSR標(biāo)記2DL22和2DL25之間。Yang等[28]于2017年將控制小麥三雌蕊性狀基因Pis1定位在標(biāo)記M70和M71之間，兩個標(biāo)記與Pis1的遺傳距離分別為1.1 cM 和3.0 cM。Zhu等[25]于2019年開發(fā)了4個SSR標(biāo)記將控制小麥三雌蕊性狀的基因12TP定位在2DL染色體上，兩側(cè)標(biāo)記遺傳距離7.58 cM。Yu等[29]于2020年利用BSA構(gòu)建了三雌蕊位點(diǎn)(Pis1)的部分遺傳連鎖圖譜。這些研究都將三雌蕊基因定位在小麥2D染色體上，所有這些研究都表明在2DL染色體臂上有一個控制三雌蕊表型的基因座。將已報道三雌蕊基因連鎖標(biāo)記的物理圖譜與本實(shí)驗(yàn)中所用標(biāo)記的物理圖譜進(jìn)行了比較(圖3，C)發(fā)現(xiàn)， Yang等[28]通過M70和M71標(biāo)記定位的Pis1物理位置與Pis-CH257所在區(qū)段物理位置相鄰；Yu等[29]將Pis1定位在分子標(biāo)記Me5-eM33和M75之間，其物理位置與Pis-CH257區(qū)段物理位置接近，且有部分位置重合。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于遺傳背景不同所導(dǎo)致，但二者是否是等位基因還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究縮短了三雌蕊基因所在遺傳區(qū)間，但距離成功克隆三雌蕊小麥還有著不小的差距，下一步將利用來自F2的大群體篩選交換株，進(jìn)行精細(xì)作圖。

綜上所述，本研究通過對“CH257/中國春”組合的F1、B1C1和F2群體進(jìn)行遺傳分析后得出，CH257中存在一個受顯性基因控制的基因位點(diǎn)控制著小麥三雌蕊性狀，通過BSA法混池后經(jīng)90K SNP芯片掃描確定控制三雌蕊的基因Pis-CH257處于2D染色體長臂上。根據(jù)基因芯片掃描結(jié)果在2D染色體上開發(fā)了5個SSR標(biāo)記將Pis-CH257定位于2DL染色體2DL22-2DL25之間，遺傳距離分別為 1.1 cM和2.3 cM，為克隆控制小麥三雌蕊性狀的基因提供了基礎(chǔ)。