陳雅琦，莫正海，婁文睿，翟 敏，郭忠仁，宣繼萍

（江蘇省中國科學(xué)院植物研究所 a.江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室；b.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014）

薄殼山核桃Carya illinoinensis（Wangenh.）K.Koch又名美國山核桃、長山核桃，為胡桃科山核桃屬落葉大喬木，原產(chǎn)于美國和墨西哥北部，喜溫暖濕潤氣候，是優(yōu)良的干果和木本油料樹種[1-3]。近年來，國內(nèi)的薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，江蘇省內(nèi)的南京、句容、泗洪等地已開始形成局部產(chǎn)業(yè)規(guī)模[4]。隨著薄殼山核桃種植面積的不斷擴大，危害薄殼山核桃的病害種類也不斷增多。目前，我國已見報道的薄殼山核桃病害共計21種，其中已查明病原的病害有17種，未查明病原的病害有4種，煤污病為4種未查明病原的病害之一[5]。

煤污病對薄殼山核桃的危害極大，薄殼山核桃感染煤污病后其葉片、枝條的表面會產(chǎn)生大量灰色至灰黑色霉點甚至霉層，使得葉片正常的光合作用受到阻礙，進而影響樹勢、果實產(chǎn)量及品質(zhì)[6]。為了解薄殼山核桃煤污病的發(fā)病率、感病指數(shù)及其與品種間的關(guān)系，明確煤污病的致病病菌，本研究調(diào)查了6個不同的薄殼山核桃品種，統(tǒng)計并計算其煤污病的發(fā)病率及感病指數(shù)；并以‘斯圖爾特’染病葉片為病原菌提取材料，通過形態(tài)學(xué)觀察及rDNA-ITS序列分析對煤污病病原菌進行鑒定，并采用柯赫氏法則加以驗證，以期為薄殼山核桃抗煤污病品種的選擇與煤污病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 薄殼山核桃煤污病病害調(diào)查

1.1.1 調(diào)查地點及調(diào)查對象概況

調(diào)查地點位于南京市六合區(qū)雄州街道龍虎營村的試驗基地（118°53′17″E，32°18′24″N），為中緯度地區(qū)，屬北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，雨水充沛。1月的平均氣溫為2.2 ℃，7月的平均氣溫為27.9 ℃。

基地內(nèi)種植的薄殼山核桃品種分別為‘波尼’‘金華’‘馬罕’‘斯圖爾特’‘紹興’‘威奇塔’，于2013年春定植，種植密度為4 m×8 m。

1.1.2 煤污病病害的調(diào)查

每個薄殼山核桃品種隨機調(diào)查3株，選取各樣株樹冠范圍內(nèi)離地面0～2 m高的小葉調(diào)查煤污病的發(fā)病狀況，按下式計算其發(fā)病率，參考方中達[7]所用的分級計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合實際情況制定薄殼山核桃煤污病病情分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1 薄殼山核桃煤污病感病指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Classification standard for sooty mold disease index of pecan

1.2 薄殼山核桃煤污病病原菌的分離與鑒定

1.2.1 病原菌的分離純化

使用無菌挑針輕輕刮取病葉上的霉層，將適量霉層粉末置于裝有1 mL無菌水的離心管中，輕輕振蕩制成孢子懸浮液。用酒精燈灼燒接種環(huán)，待接種環(huán)冷卻后蘸取孢子懸浮液，在PDA平板表面連續(xù)劃線，于24 ℃的溫度條件下進行黑暗培養(yǎng)以獲得單菌落。挑取單菌落邊緣的菌絲，再將其轉(zhuǎn)移至新的PDA平板上培養(yǎng)以獲得純化菌株，并于25 ℃的溫度條件下進行黑暗培養(yǎng)，分別于黑暗培養(yǎng)7、14、28 d時觀察菌落的生長狀態(tài)。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

使用粘片法[8]對培養(yǎng)7、14或28 d后的病原菌分別進行形態(tài)學(xué)的鑒定：剪取小段透明膠，輕輕粘取菌絲或者孢子后將此小段透明膠置于滴有浮載劑的載玻片上，于顯微鏡下觀察病原菌菌絲、分生孢子梗和分生孢子的形狀、顏色及大小。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

使用OMEGA真菌DNA提取試劑盒提取病原菌的DNA，選取通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′）對 真 菌DNA的ITS片段進行擴增。反應(yīng)體系為：50 μL，包含1 μL的DNA模板，25 μL的2×TSINGKE Master Mix（Blue），引物ITS1及ITS4各取1 μL（10 μmol/L），無菌超純水22 μL。PCR的擴增程序為：首先在94 ℃的條件下進行5 min的預(yù)變性；然后在94 ℃的條件下變性30 s，在58 ℃的條件下退火30 s，在72 ℃的條件下延伸30 s，共計35個循環(huán)；最后在72 ℃的條件下進行10 min的終延伸。將PCR產(chǎn)物置于1%的瓊脂糖中進行凝膠電泳檢測，回收目的片段，然后將回收到的目的片段送往南京擎科生物科技有限公司進行測序。將測序所獲得的序列置于NCBI網(wǎng)站中進行同源性Blast比對，隨后下載相關(guān)真菌的ITS序列，再使用ClustalX 1.81軟件進行多序列比對，采用MEGA X軟件內(nèi)置的鄰位連接法（Neighbor-Joining Method，NJ）[9]進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（No.of Bootstrap Replications參數(shù)設(shè)為1 000，其余參數(shù)均為默認）。

1.2.4 病原菌致病性的驗證

選擇薄殼山核桃幼苗上的健康葉片為接種材料，使用無菌水清洗葉片后，將孢子懸浮液涂抹在葉片表面上[7]，以清洗后涂抹無菌水的葉片作為對照，在溫度為25 ℃、濕度為95%的條件下進行12 h光照/12 h黑暗的交替培養(yǎng)。霉斑形成后，從接種部位再次分離病原菌，進行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，觀察其是否與原接種病原菌相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄殼山核桃不同品種的發(fā)病率和感病指數(shù)

薄殼山核桃煤污病主要發(fā)生在葉片和枝條上，不同病級的煤污病典型癥狀如圖1所示。從圖1中可以看出，感病指數(shù)最高的病級是V級。感染煤污病后葉片的上表面會形成黑色的霉層，而葉片的下表面并沒有受到煤污病的危害。6個薄殼山核桃品種的發(fā)病率和感病指數(shù)見表2。由表2可知，6個薄殼山核桃品種的發(fā)病率從高到低依次為：‘紹興’（66.79%）、‘斯圖爾特’（61.98%）、‘威奇塔’（54.08%）、‘金華’（48.79%）、‘馬罕’（27.17%）和‘波尼’（24.13%）。6個品種中，煤污病感病指數(shù)最高的是‘斯圖爾特’，其感病指數(shù)為39.35；其次依次是‘紹興’‘威奇塔’‘金華’，其感病指數(shù)分別為32.34、24.23、21.82；‘馬罕’和‘波尼’的感病指數(shù)均較低，分別為14.12與11.07。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，‘紹興’的發(fā)病率最高，而其發(fā)病的嚴重程度稍低；‘斯圖爾特’的發(fā)病率不如‘紹興’，但其嚴重程度比‘紹興’的高，且為6個品種中的最高者；‘威奇塔’‘金華’‘馬罕’‘波尼’的發(fā)病率與感病指數(shù)的排名均一致。綜合而言，‘斯圖爾特’和‘紹興’遭受煤污病危害的程度均較重，均為重度受害品種（其中，‘斯圖爾特’的受害程度最大），‘威奇塔’和‘金華’均為中等受害品種，‘馬罕’和‘波尼’為輕度受害品種。

表2 6個薄殼山核桃品種的發(fā)病率和感病指數(shù)?Table 2 Incidence and disease index of six pecan cultivars

圖1 不同病級的薄殼山核桃煤污病的發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of pecan sooty mold in different disease grades

2.2 薄殼山核桃煤污病病原菌的分離與鑒定結(jié)果

2.2.1 薄殼山核桃煤污病菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)過多次分離純化及顯微觀察，初步篩選得到了3種不同的煤污病菌，分別編號為B04、F03和G07，其在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖2所示，3種煤污病病原菌的顯微結(jié)構(gòu)如圖3所示。

觀察發(fā)現(xiàn)，菌株B04在培養(yǎng)基上生長14 d后其菌落直徑約為6 cm。從圖2A中可以看出，菌落正面呈絨狀，橄欖綠至深灰綠色，邊緣菌絲白色，可見同心圓輪紋；菌落背面，綠褐色至墨綠色，邊緣白色。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該真菌分生孢子梗單生，直立，側(cè)生或頂生，常具有隔膜，分隔處不收縮，淡褐色，光滑，具孢痕；分枝分生孢子呈圓柱形，無隔膜或具有1個隔膜，分枝分生孢子的大小為（12～23）×（3～4）μm；分生孢子多鏈生于分枝分生孢子頂部，橢圓形或檸檬形，分生孢子的大小通常為（3.5～8.0）×（2.5～4.0）μm（圖3A）。該菌落的形態(tài)與有關(guān)文獻[10-12]描述的枝孢屬Cladosporium真菌的形態(tài)相似，據(jù)此可初步鑒定其為枝孢屬某真菌。

圖2 PDA培養(yǎng)基上3種煤污病病原菌的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of three pathogens of sooty mold on PDA

圖3 3種煤污病病原菌的顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of three pathogens of sooty mold

菌株F03在培養(yǎng)基上初為臟白色，菌落光滑粘稠，生長7 d后，其菌落直徑還不到3 cm。菌落表面平展，呈油漆狀，墨綠色至黑色，邊緣呈根狀（圖2B）。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該真菌菌絲深褐色，常斷裂成小段，單個細胞呈磚型形，寬5.5～7.0 μm；分生孢子梗不明顯；孢子透明、淡綠至深褐色，形態(tài)各異，單孢橢圓形，光滑，常為深褐色，單孢大小為（5.5～8.5）×（2.5～4.5）μm；雙孢常呈葫蘆形，兩端鈍圓，光滑，淡綠至深褐色，雙孢的尺寸為（8.5～16）×（5.5～7.5）μm（圖3B）。菌株F03的形態(tài)與有關(guān)文獻[13-14]描述的短梗霉屬Aureobacidium真菌的形態(tài)相似，據(jù)此可初步鑒定其為短梗霉屬真菌。

菌株G07生長緩慢，培養(yǎng)基上生長28 d后其菌落直徑還不到2 cm。菌落表面褶皺，中部隆起，深褐色至黑色，可見少量菌絲（圖2C）。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該真菌菌絲呈褐色，常由多根菌絲組合成束狀而生長；分生孢子單生，褐色，光滑，具有分生孢子臂，使得整個孢子呈星狀；分生孢子臂著生的基部細胞直徑為2～3 μm，單個分生孢子具有3～4個分生孢子臂；每個分生孢子臂具有2～3個隔膜，隔膜處稍收縮，整臂長為16～20 μm，上窄下寬，近圓錐形，基部寬為6～7 μm，頂端寬為1～3 μm（圖3C）。菌株G07的形態(tài)與有關(guān)文獻[15-16]描述的多臂菌屬Trichomerium真菌的形態(tài)相似，據(jù)此可初步鑒定其為多臂菌屬真菌。

2.2.2 薄殼山核桃煤污病菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

提取病原菌核基因組DNA后，采用ITS1/ITS4引物進行ITS片段的PCR擴增。將純化回收后的目的片段進行測序，然后利用NCBI網(wǎng)站將測序結(jié)果進行Blast比對，下載相關(guān)序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析結(jié)果表明，病原菌B04的ITS序列與枝狀枝孢C.cladosporioides（LC515108.1）的序列的相似性較高，以ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，病原菌B04與枝狀枝孢C.cladosporioides可聚為一類。結(jié)合形態(tài)特征鑒定結(jié)果分析，可將煤污病菌株B04鑒定為枝狀枝孢C.cladosporioides。

圖4 菌株B04的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain B04

病原菌F03的ITS序列與出芽短梗霉A.pullulans的序列（DQ309591.1）的相似性較高，以ITS序列構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，病原菌F03與出芽短梗霉A.pullulans可聚為一類。結(jié)合形態(tài)特征鑒定結(jié)果分析，可將煤污病菌株F03鑒定為出芽短梗霉A.pullulans。

圖5 菌株F03的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain F03

病原菌G07的ITS序列與薯蕷多臂菌T.dioscoreae的序列（NR137946.1）的相似性較高，以ITS序列構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖6所示。圖6表明，病原菌G07與薯蕷多臂菌T.dioscoreae可聚為一類。結(jié)合形態(tài)特征鑒定結(jié)果分析，可將煤污病菌株G07鑒定為薯蕷多臂菌T.dioscoreae。

圖6 菌株G07的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain G07

2.2.3 病原菌致病性的測定結(jié)果

為了驗證病原菌的致病性，本研究將純化的菌株B04、F03及G07分別接種至薄殼山核桃葉片上，接種后觀察發(fā)現(xiàn)，葉片表面形成灰黑色霉斑，且菌株B04形成霉斑的速度最快，其次依次是菌株F03與G07，而對照葉片未產(chǎn)生霉斑。觀察從發(fā)病部位重新分離培養(yǎng)得到的菌株發(fā)現(xiàn)，其與接種前所用純化菌株一致，這表明枝狀枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蕷多臂菌T.dioscoreae均可導(dǎo)致薄殼山核桃煤污病的發(fā)生。

3 討 論

煤污病病原菌的孢子或者菌絲體碎片通常借助雨水或氣流進行傳播。當(dāng)孢子或者菌絲在含有蜜露的基質(zhì)上萌發(fā)后，煤污病病原菌會在植株表面上生長。發(fā)病初期，植株體表可產(chǎn)生黑色煙煤狀物質(zhì)或覆蓋絨毛狀物，隨后霉斑擴大并連接成片，最終形成霉層布滿整個葉片、嫩枝及果實；發(fā)病后期，部分由病原菌造成的煙煤狀物上會形成子囊殼、分生孢子器等結(jié)構(gòu)，越冬后成為第2年的初侵染來源，并可造成多次的再侵染[6,17]。煤污病發(fā)病盛期分別為每年的3—6月和9—11月，其發(fā)病高峰期往往和蚜蟲、蚧殼蟲和粉虱等刺吸式害蟲的危害盛期一致[18]。有關(guān)大麥[19]、赤楠[20]、文冠果[21]等植物煤污病的研究結(jié)果均表明，煤污病的發(fā)生與蚜蟲相伴相生。蚜蟲在攝取植物汁液中的水分和可溶性碳水化合物的同時，分泌出大量的粘性蜜露附著在葉片表面，這些富含營養(yǎng)物質(zhì)的蜜露成為霉菌的培養(yǎng)基，從而誘導(dǎo)煤污病的發(fā)生[22]。已有研究結(jié)果表明，在薄殼山核桃中，煤污病的發(fā)生同樣是由于蚜蟲分泌的蜜露造成的[23]。而蜜露不易附著于葉片的下表面，這可能是薄殼山核桃煤污病主要危害葉片上表面的原因。研究中發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃不同品種遭受煤污病危害的程度有所不同，其中一個很重要的原因可能是，不同品種的葉片表面形態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異[24]?！箞D爾特’與‘紹興’的葉片表面均較粗糙，這使得蜜露易附著在葉片表面上；而‘馬罕’與‘波尼’的葉片表面均較光滑，蜜露不易附著在葉片表面上。葉片附著蜜露能力的差異性可能導(dǎo)致了不同品種遭受煤污病危害的程度不同。

煤污病病原菌種類豐富，可以組成不同的群落致使植物發(fā)病，且不同地區(qū)主要流行的煤污病病原菌群落也存在差異。姜廣正等[25]調(diào)查發(fā)現(xiàn)：北京、天津、煙臺和南京地區(qū)的一些植物上煤污菌的群落組合均較簡單，僅限于出芽短梗霉A.pullulans、枝孢屬Cladosporium、鏈格孢屬Alternaria這3個種群；而杭州和青島等地區(qū)一些植物上煤污菌的群落組合不但比較復(fù)雜，而且出現(xiàn)了少見的種群，如麥提多綹孢Tripospermum mytti。研究中發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃煤污病病原菌由枝狀枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蕷多臂菌T.dioscoreae組成，其中的枝狀枝孢C.cladosporioides與出芽短梗霉A.pullulans均屬于南京地區(qū)常見的煤污病病原菌種群，而薯蕷多臂菌T.dioscoreae模式種是日本學(xué)者從薯蕷葉片上分離得到的[16]，在我國云南及陜西的芒果、山楂樹上均被發(fā)現(xiàn)，其可導(dǎo)致煤污病的發(fā)生[15]。目前，南京地區(qū)此前未有過該病原菌的相關(guān)報道，其原因可能是，該病原菌的存在可能與供試薄殼山核桃的生長環(huán)境有關(guān)（采樣地點位于南京六合區(qū)農(nóng)村，地處靈巖山山腳下），人類的采集行為或者野生動物的活動使得病原菌的傳播范圍從山上擴大到山腳下，同時生長在薄殼山核桃附近的植物中也可能存在提供侵染來源的儲存寄主[15,26]。

枝狀枝孢C.cladosporioides是一種常見的腐生菌，具有單孢型的分生孢子梗，孢子梗不會膨大，產(chǎn)生孢子后也不再延長，其上產(chǎn)生的分枝分生孢子上又會產(chǎn)生體小而數(shù)量多的鏈狀分生孢子，在外力作用下極易分散，直接觀察材料時容易被忽略，但人工培養(yǎng)時則極易獲得[10,27]。觀察發(fā)現(xiàn)，該病原菌分離得到的孢子數(shù)量多，菌絲生長速度快，并且極易在葉片上形成霉斑，這種生長優(yōu)勢可能是其成為薄殼山核桃煤污病主要致病菌的重要原因。

出芽短梗霉A.pullulans是一種類酵母真菌，不同的環(huán)境條件可導(dǎo)致其形態(tài)的改變，細胞常呈菌絲狀或酵母狀，可形成節(jié)孢子、芽分生孢子、厚垣孢子等[14]。出芽短梗霉A.pullulans的分布范圍廣，植物體、石灰?guī)r及海洋中都可分離到此真菌，其具有很高的滲透壓耐受性，同時其分泌的胞外多糖具有黏性，使得該真菌極易黏附在物體表面上[28]。該真菌的易于附著于物體表面的特點，可能是導(dǎo)致薄殼山核桃煤污病發(fā)生的一個重要原因。周小燕等[27]認為，散播煙霉Fumago vagans是柑橘煤污病的優(yōu)勢病原菌之一；而陸家云[13]與李榮禧等[29]則認為，煤污病病原菌之一的散播煙霉Fumago vagans實質(zhì)上為出芽短梗霉A.pullulans、枝孢Cladosporiumspp.、鏈格孢Alternariasp.這三者或者前兩者的混合體。在對薄殼山核桃煤污病病原菌進行初步分離時發(fā)現(xiàn)，出芽短梗霉A.pullulans與枝狀枝孢C.cladosporioides常一起生長，這可能是由出芽短梗霉A.pullulans分泌的胞外多糖的物理黏附作用所致，而非代謝產(chǎn)物間的相互影響所致[25]。

多臂菌Trichomeriumspp.原屬于座囊菌綱Dothideomycetes煤炱目Capnodiales的真菌，后來被歸到散囊菌綱Eurotiomycetes刺盾炱目Chaetothyriales中[30]，該類真菌菌絲多分支，常勾連成束狀、網(wǎng)狀，在葉表面生長[15]，本研究中分離得到的薯蕷多臂菌T.dioscoreae在培養(yǎng)基上及葉片上生長的形態(tài)與該屬真菌菌絲的生長形態(tài)一致，其復(fù)雜立體的結(jié)構(gòu)使得該病原菌不易被水流和氣流沖走，菌絲間的空隙為其它煤污病病原菌的附著及生長提供了有利的條件，從而導(dǎo)致病害的發(fā)生。

煤污病的分布范圍廣，危害的植物種類多，且菌落組成成分復(fù)雜，是一種常見的病害，而有關(guān)此病害的研究報道卻少。目前，有關(guān)煤污病的研究內(nèi)容主要集中在病原菌的分離鑒定、危害及防治等方面。本研究分離鑒定了3種薄殼山核桃煤污病的病原菌，但對這3種病原菌的組成比例卻未作研究，不同品種的薄殼山核桃間其病原菌的組成比例是否有變化，對此問題仍待研究。薄殼山核桃在煤污病脅迫下其自身的生理生化變化及生長與抗病反應(yīng)間的權(quán)衡，也是下一步研究的重點。

4 結(jié) 論

綜上所述，不同薄殼山核桃品種的發(fā)病率和感病指數(shù)存在差異，煤污病對‘斯圖爾特’和‘紹興’的危害最嚴重，對‘威奇塔’和‘金華’的危害程度中等，對‘馬罕’和‘波尼’的危害最輕。枝狀枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蕷多臂菌T.dioscoreae均可導(dǎo)致薄殼山核桃煤污病的發(fā)生。