曾一芳，邱道揚(yáng)，陳麗麗，趙 利，文陽(yáng)平，湯凱潔*

（1.江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 功能材料與農(nóng)業(yè)應(yīng)用化學(xué)研究所，江西 南昌 330045）

【研究意義】磺胺類（Sulfonamides，SAs）抗生素是一類廣譜抗菌藥物的總稱，在臨床上常被用于預(yù)防和治療革蘭氏陽(yáng)性菌或陰性菌感染的疾病，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中預(yù)防和治療疾病[1]。對(duì)氨基苯磺酰胺（Sulfanilamide，SA），簡(jiǎn)稱磺酰胺，是磺胺類藥物中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一種，也是其他磺胺衍生物的母體結(jié)構(gòu)。有報(bào)道SAs 在食品中的殘留對(duì)消費(fèi)者健康具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)、誘導(dǎo)人體產(chǎn)生耐藥性、損害泌尿系統(tǒng)、降低人體免疫力、嚴(yán)重的甚至?xí)种瓢准?xì)胞合成或誘發(fā)癌癥風(fēng)險(xiǎn)等[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究表明水中的磺胺類溶度在0.15～0.30 mg/dm3可以改變鯉魚血漿中蛋白質(zhì)圖譜[3]。隨著SAs 藥物在養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用，加之養(yǎng)殖戶法律意識(shí)淡薄以及趨利心理，常有不遵守休藥期或擅自加大用藥量行為的發(fā)生，導(dǎo)致SAs 藥物在食品中的殘留問(wèn)題日趨嚴(yán)重。從福建養(yǎng)殖的草魚、羅非魚和鰻魚中36 種抗生素的殘留檢測(cè)結(jié)果分析，磺胺嘧啶含量高達(dá)161.2 μg/kg[4]，超過(guò)國(guó)家安全限量標(biāo)準(zhǔn)（100 μg/kg）。埃及的K?rkan 等[5]報(bào)道了13 個(gè)蜂蜜樣品中有4 個(gè)樣品為陽(yáng)性。越南的Yen等[6]報(bào)道了40 個(gè)蝦樣品中有22.5%檢出抗生素殘留，包括SAs 的殘留。加拿大的Dinh 等[7]報(bào)道了56 個(gè)海產(chǎn)品中SAs 的檢出率為11%，可見SAs 在食品中的殘留是全球性的問(wèn)題，應(yīng)該引起各國(guó)監(jiān)管部門高度重視。目前檢測(cè)磺胺類藥物的常見方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS）法[9]、免疫分析法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]等。HPLC 和LC-MS 法檢測(cè)SAs 不僅定性定量準(zhǔn)確，而且可以實(shí)現(xiàn)多殘留同時(shí)檢測(cè)，是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的一種方法。

【本研究切入點(diǎn)】但是采用HPLC，LC-MS方法，樣品一般都需要經(jīng)過(guò)多步液液萃取、凈化柱凈化和富集等操作。這些預(yù)處理不僅步驟繁瑣、耗時(shí)，而且消耗多種有機(jī)試劑，污染環(huán)境和對(duì)操作人員的健康造成潛在危害；另外這些大型儀器比較昂貴，且需要熟練的專業(yè)技術(shù)人員操作，因此難于滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)要求。免疫分析方法需要免疫動(dòng)物制備抗體，成本較高，而且生物抗體脆弱，容易受環(huán)境條件影響；毛細(xì)管電泳法進(jìn)樣量少，電滲會(huì)因樣品組成而變化，進(jìn)而影響分離和重現(xiàn)性。隨著食品工業(yè)快速的發(fā)展及市場(chǎng)需求水平的提高，操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、成本低的電化學(xué)傳感檢測(cè)方法已成為研究的熱點(diǎn)[12-13]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】理想的修飾材料能提高工作裸電極（玻碳電極）對(duì)磺酰胺的響應(yīng)靈敏度，對(duì)建立簡(jiǎn)便快速、穩(wěn)定性好和靈敏度高的電化學(xué)傳感方法至關(guān)重要。羧基化碳納米管（COOH-CNTs）以其獨(dú)特的一維圓管結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的電子傳遞特性和化學(xué)穩(wěn)定性等成為電極修飾材料研究的熱點(diǎn)之一，表面大量羧基化的化學(xué)活性位點(diǎn)對(duì)電極進(jìn)行修飾可以提高檢測(cè)方法的靈敏度[14-15]。本文制備了羧基化碳納米管修飾的玻碳電極，并通過(guò)DPV 研究磺酰胺在該修飾電極上的電化學(xué)行為及優(yōu)化了電化學(xué)檢測(cè)條件。以草魚和牛奶為加標(biāo)樣品，建立的檢測(cè)方法回收率高和穩(wěn)定性好，取得了滿意的結(jié)果，適用于草魚和牛奶中磺酰胺殘留檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

磺酰胺（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；羧基化碳納米管（COOH-CNTs，98%，中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司）；氯化鉀、羧甲基纖維素鈉、氫氧化鈉、磷酸、醋酸、硼酸、乙腈等其他試劑均為分析純；鐵氰化鉀混合液由5 mmol/L[Fe（CN）6]3-、5 mmol/L[Fe（CN）6]4-和0.1 mmol/L KCl 配制；0.04 mol/L Britton Robison（BR）緩沖溶液由0.04 mol/L 磷酸溶液、醋酸溶液以及硼酸配制，并用0.04 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值得到所需緩沖液；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

草魚：購(gòu)于南昌市不同養(yǎng)殖場(chǎng)；牛奶為市售蒙牛純牛奶、伊利純牛奶、陽(yáng)光鮮牛奶。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI620E 電化學(xué)工作站（上海辰華）；SB-5200D 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；CT-6023便攜式pH 計(jì)（成都恒通興業(yè)科技有限責(zé)任公司）；WS70-1紅外快速干燥箱（鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司）；玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE，Φ=3 mm）、飽和甘汞電極（SCE）、鉑電極（武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司）；TG16G離心機(jī)（常州市金壇勒普儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玻碳電極的預(yù)處理 首先在干凈的麂皮上撒少許0.05 μm 粒度的Al2O3拋光粉，加適量超純水混勻至形成白色漿狀物，垂直均勻畫“8”字打磨電極至光亮鏡面，再依次用超純水、無(wú)水乙醇、超純水于超聲清洗機(jī)中超聲清洗5 min。電極取出后用超純水沖洗，氮?dú)獯蹈呻姌O上的水膜后采用循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）在濃度為5 mmol/L 的鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行掃描（掃描速率50 mV/s，掃描電壓范圍為-0.2～0.6 V），得到對(duì)稱、可逆的氧化還原峰，當(dāng)峰電位差（ΔEp）小于100 mV即為合格，可以保證每次實(shí)驗(yàn)電極的表面狀態(tài)和性能基本一致。

1.3.2 不同材料修飾電極的制備 分別精確稱取1.00 mg 羧基化碳納米管（carboxylic carbon nanotubes，COOH-CNTs）、氨基化碳納米管（aminated carbon nanotubes，NH2-CNTs）、摻鉑石墨烯（platinum-doped graphene，Pt-Gr）、多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）、摻氮石墨烯（nitrogen-doped graphene，N-Gr）、二硫化鎢（tungsten disulfide，WS2）、羧基化石墨烯（carboxyl graphene，COOH-Gr，分別分散到1 mL 0.3 mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中，超聲30 min，制成7種濃度為1 mg/mL的分散液。在玻碳電極表面滴涂一定量修飾材料的分散液，用DPV法檢測(cè)磺酰胺。

1.3.3 DPV 法測(cè)定磺酰胺 將電極放入5.0 mL pH=7.0的BR 緩沖溶液中掃描多次至溶液穩(wěn)定，取20 μL 1 mg/mL 的磺酰胺標(biāo)準(zhǔn)液于緩沖溶液中，攪拌溶液1 min 并靜置1 min 后在電位范圍為0.3～1.3 V 用DPV進(jìn)行檢測(cè)。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫，所有峰值電流的分析數(shù)據(jù)都是通過(guò)切線法扣除背景電流得到的DPV峰高。

1.3.4 樣品的制備 草魚樣品：取2 g剪小并搗碎的草魚樣品于離心管中，加5 mL乙腈提取液，渦旋震蕩2 min，超聲處理10 min，4 000 r/min 條件下離心10 min 后取上清液，剩余殘?jiān)? mL 乙腈提取液重復(fù)提取1次，合并2次上清液，用乙腈定容至5 mL待用；牛奶樣品：取50 μL牛奶樣品置于離心管中，加入乙腈溶液，混勻后渦旋振蕩2 min，超聲處理10 min，然后在12 000 r/min 條件下離心30 min，取上清液乙腈定容至5 mL待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 修飾電極材料的篩選

玻碳裸電極電催化性能比較弱，為了提高電極對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的靈敏度，比較了7 種不同修飾材料對(duì)磺酰胺的電化學(xué)響應(yīng)，以制備的修飾電極作為工作電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，甘汞電極作為參比電極構(gòu)成三電極體系。DPV實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，磺酰胺在氨基化碳納米管（NH2-CNTs）、多壁碳納米管（MWCNTs）、二硫化鎢（WS2）3 種修飾材料的峰電流比較弱，所以這3 種DPV 圖沒(méi)有放在圖1。圖1 只選擇了COOH-CNTs、摻鉑石墨烯（Pt-Gr）、摻氮石墨烯（N-Gr）、羧基化石墨烯（COOH-Gr）4 種修飾電極和裸玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）在含2.3×10-5mol/L 磺酰胺的BR 緩沖液（pH=8.5）的DPV 掃描圖。如圖1所示，磺酰胺在COOH-CNTs 修飾的電極峰電流響應(yīng)最大（11.89 μA），且催化電位相對(duì)于其他的材料也略低（0.76 V），說(shuō)明COOH-CNTs對(duì)磺酰胺的氧化具有最好的電催化作用。其次是N-Gr，最差的是COOH-Gr。因此，后面的實(shí)驗(yàn)都采用COOH-CNTs 修飾GCE制備工作電極（COOH-CNTs/GCE）。

圖1 4種不同修飾材料制備工作電極的DPV掃描圖Fig.1 The comparison of DPV between bare electrode and four modified electrodes

2.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.2.1 電極修飾材料用量的確定 采用滴涂和紅外干燥法修飾電極時(shí)，如果修飾材料用量過(guò)少，則無(wú)法將裸玻碳電極表面覆蓋完全，不能完全發(fā)揮出修飾材料的優(yōu)勢(shì)；當(dāng)修飾材料用量過(guò)多時(shí)，修飾材料在電極表面形成的薄膜厚度過(guò)大，導(dǎo)致電子移動(dòng)距離增大，不僅不能提升電極的靈敏度，甚至可能會(huì)削弱電極對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)，從而直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以需要對(duì)電極修飾材料用量進(jìn)行優(yōu)化，選擇合適的滴涂量以提高電極的氧化響應(yīng)靈敏度。

滴涂不同體積的COOH-CNTs后在相同濃度的磺酰胺溶液中用DPV法進(jìn)行掃描。如圖2所示，當(dāng)修飾用量在4～5 μL 的范圍內(nèi)峰值電流呈急劇上升趨勢(shì)，5 μL 達(dá)到最大值，當(dāng)用量在5～9 μL 時(shí)隨著滴涂用量的增加，磺胺的峰值電流反而直線下降，且9 μL峰電流值最小。這是由于COOH-CNTs 在電極表面分布達(dá)到飽和，再增加滴涂量也不會(huì)再增加電極的比表面積和催化性能，故電極修飾用量選取5 μL作為后面實(shí)驗(yàn)的最適修飾用量。

圖2 修飾材料用量與峰值電流關(guān)系的對(duì)比Fig.2 The comparison of the relation between the amount of modification material and the peak current

2.2.2 緩沖液pH 值的選擇 電化學(xué)傳感方法檢測(cè)待測(cè)物的原理是被分析物在工作電極上的電化學(xué)行為與濃度變化關(guān)系，如電流響應(yīng)大小隨物質(zhì)濃度變化的關(guān)系。而電解質(zhì)溶液的pH值會(huì)影響工作電極環(huán)境中電子和質(zhì)子的含量，從而直接影響電極氧化響應(yīng)的靈敏度。COOH-CNTs 修飾電極在不同pH 值（pH=6.0、pH=6.5、pH=7.0、pH=7.5、pH=8.0、pH=8.5、pH=9.0）的BR 緩沖溶液中對(duì)相同濃度的磺酰胺溶液的氧化響應(yīng)電化學(xué)表征。

如圖3 所示，緩沖液pH 值在6.0～8.5，磺酰胺的氧化響應(yīng)峰的峰值電流在逐漸增大。當(dāng)緩沖液的pH值達(dá)到8.5 時(shí)，氧化響應(yīng)峰值電流達(dá)到最大值。之后隨著pH 值的增大，峰值電流又開始逐漸減小，這表示緩沖液在pH 為8.5 時(shí)，修飾電極對(duì)磺酰胺的氧化還原響應(yīng)最強(qiáng)，故選取pH=8.5 的BR 緩沖液作為實(shí)驗(yàn)的最佳電解質(zhì)溶液。

圖3 不同pH的緩沖液對(duì)磺酰胺電化學(xué)響應(yīng)的影響Fig.3 The effect of buffers with different pH values on the electrochemical response of sulfanilamide

2.3 COOH-CNT/GCE的電化學(xué)表征

2.3.1 COOH-CNT/GCE 的電化學(xué)阻抗性能 交流阻抗性能可以反應(yīng)電極導(dǎo)電性的強(qiáng)弱，為了研究修飾電極COOH-CNT/GCE 的導(dǎo)電性，進(jìn)行了交流阻抗實(shí)驗(yàn)，在5 mmol/L 的鐵氰化鉀混合液中研究了電極的界面性質(zhì)，通過(guò)奈奎斯特圖中半圓的直徑來(lái)評(píng)價(jià)不同改性的電極的轉(zhuǎn)移電阻（Rct）。從圖4 可以看出，COOH-CNT/GCE 的電極明顯比未修飾電極的Rct小，反映了采用COOH-CNT 材料修飾玻碳電極后大大提高了工作電極的導(dǎo)電能力。

圖4 在5 mmol/L鐵氰化鉀混合液中GCE和COOH-CNT/GCE 的奈奎斯特圖Fig.4 The nyquist plots of GCE and COOH-CNT/GCE in 5 mmol/L potassium ferricyanide mixture

2.3.2 COOH-CNT/GCE 電極催化有效面積 電極催化有效表面積的大小決定了電化學(xué)傳感器的響應(yīng)位點(diǎn)數(shù)量，通常有效面積越大，電極電催化性能越好，響應(yīng)靈敏度越高。在含0.1 mol/L KCl 的1 mmol/L K3[Fe（CN）6]為支撐電解質(zhì)溶液中，對(duì)所制備的電化學(xué)傳感器進(jìn)行了電化學(xué)有效表面積的研究。圖5顯示COOH-CNT/GCE大大提高了未修飾電極的電化學(xué)有效面積，增強(qiáng)了對(duì)磺酰胺的識(shí)別與響應(yīng)。

圖5 在含0.1 mmol/L的1 mmol/L的鐵氰化鉀溶液中對(duì)GCE和COOH-CNT/GCE 的電化學(xué)有效表面積測(cè)試Fig.5 The electrochemically available surface area measurements of GCE and COOH-CNT/GCE in 1 mmol/L potassium ferricycyanide solution containing 0.1 mmol/L

2.3.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限的計(jì)算 在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，用修飾電極在0.3～1.3 V 電位下采用DPV 法對(duì)含不同濃度磺酰胺（9.29×10-6，1.63×10-5，1.97×10-5，2.32×10-5，3.25×10-5，8.31×10-5，1.16×10-4，2.32×10-4，2.90×10-4mol/L）的緩沖液進(jìn)行檢測(cè)分析，得到不同濃度下的氧化響應(yīng)峰值電流圖。根據(jù)濃度與氧化峰值電流的關(guān)系，以濃度為橫軸、峰值電流為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，磺酰胺濃度在9.29×10-6～2.9×10-4mol/L的范圍內(nèi)，氧化響應(yīng)峰值電流與磺酰胺濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.008 7x+0.095 5，R2=0.991 6，檢測(cè)限為6.21×10-6mol/L。

圖6 磺酰胺濃度與峰電流響應(yīng)的線性關(guān)系Fig.6 Linear relationship between sulfonamide concentration and peak current

2.3.4 重復(fù)性和重現(xiàn)性 使用同一根COOH-CNTs 修飾電極在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)含2.3×10-5mol/L 磺酰胺濃度的緩沖溶液進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，采用DPV 法重復(fù)掃描12 次（如圖7A），測(cè)得12 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的氧化峰值電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.99%，表明該傳感器對(duì)磺酰胺檢測(cè)的重復(fù)性非常好。

使用6 根COOH-CNTs 修飾的不同電極，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)含2.3×10-5mol/L 磺酰胺濃度的緩沖溶液進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，使用DPV 法重復(fù)掃描5 次得到平均峰電流值（如圖7B），測(cè)得平均氧化峰值電流值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=3.74%，表明該傳感器對(duì)磺酰胺檢測(cè)的重現(xiàn)性良好。

圖7 DPV法掃描同一根修飾電極峰值電流變化（A）；6根COOH-CNT/GCE 修飾電極的峰值電流變化（B）Fig.7 Peak current variation diagram of the same modified electrode by DPV method（A）；Peak current changes of six COOH-CNTs/GCE modified electrodes（B）.

2.3.5 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)及實(shí)際樣品的測(cè)定 加標(biāo)回收率的測(cè)定不僅可以評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)對(duì)方法的影響，而且可以評(píng)估該方法的準(zhǔn)確度[16-17]。采用江西最大的淡水魚品種草魚和蒙牛牛奶作為加標(biāo)樣品進(jìn)行方法驗(yàn)證，選擇了4個(gè)不同的加標(biāo)濃度，測(cè)定了加標(biāo)回收率和RSD值，結(jié)果見表1。

由表1 可知，添加4 個(gè)不同濃度的草魚加標(biāo)回收率在97.91%～105.32%，RSD 在0.81%～2.79%。牛奶樣品的加標(biāo)回收率達(dá)到91.48%～101.75%，RSD 在0.63%～3.72%?？梢姳狙芯恳圆蒴~和鮮奶樣品為基質(zhì)建立的電化學(xué)傳感方法表現(xiàn)了非常好的回收率和精密度，表明該建立的方法可以適用于上述兩類樣品檢測(cè)，進(jìn)一步采用該傳感方法檢測(cè)了10 種不同養(yǎng)殖地的草魚樣品和3 種品牌的牛奶樣品都未檢出磺酰胺殘留。

表1 草魚和牛奶樣品的加標(biāo)回收率（n=5）Tab.1 The recovery rate of grass carp and milk sample with spiked standard（n=5）

3 結(jié)論與討論

本次研究成功開發(fā)了一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高和成本低的檢測(cè)磺酰胺的電化學(xué)傳感方法，當(dāng)采用COOH-CNTs 修飾的玻碳電極表現(xiàn)出優(yōu)良的電子催化性能、高比表面積，該電極對(duì)磺酰胺電化學(xué)響應(yīng)靈敏度高。制備的電極在重復(fù)使用12次穩(wěn)定性非常好，采用相同的滴涂條件制備了6根電極，重現(xiàn)性也非常滿意。建立的電化學(xué)傳感方法檢測(cè)磺酰胺，操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高，采用該方法對(duì)草魚和牛奶樣品中磺酰胺的4個(gè)加標(biāo)濃度樣品進(jìn)行檢測(cè)，回收率為91.48%～105.32%，表明建立的方法可以適用于實(shí)際樣品檢測(cè)。從2020年磺胺類藥物殘留報(bào)道來(lái)看，水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品、鮮奶和蜂蜜產(chǎn)品，甚至飲用水等都有陽(yáng)性樣品報(bào)道，因此磺胺類在食品中的殘留應(yīng)該引起監(jiān)管部門的重視。目前已開發(fā)的磺胺類藥物有30多種，食品中常見殘留的有10多種磺酰胺的衍生物，因此后期實(shí)驗(yàn)研究能同時(shí)檢測(cè)多種磺胺的電化學(xué)傳感方法具有更重要的意義。